利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建基因編輯猴及CRISPR-Cas9系統(tǒng)應(yīng)用優(yōu)化.pdf

1、當(dāng)前醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)研究中，動物模型是不可或缺的組成部分。生命科學(xué)研究中每一種模式動物研究的突破，為遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等研究領(lǐng)域帶來了突破式的進(jìn)展。隨著科學(xué)研究的不斷深入，人類對復(fù)雜生命現(xiàn)象的不斷探索，以及人類面臨的重大疾?。ò┌Y，艾滋病，心腦血管疾病，神經(jīng)性疾病等）的威脅，低等的動物模型已無法滿足復(fù)雜的科學(xué)研究以及模擬人類重大疾病的需求。非人靈長類動物作為人類的近親，具有與人類相似的免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及代謝系統(tǒng)，是最理想的

2、甚至是唯一的模型動物。許多靈長類動物的研究成果可直接應(yīng)用于人類疾病的預(yù)測、預(yù)防、診斷和治療，而這些方面一直是人類健康領(lǐng)域關(guān)注的焦點。目前，非人靈長類動物模型構(gòu)建一直受到編輯效率低、操作困難等限制，這些困難成為制約非人靈長類動物模型研究的瓶頸。
　　近年來，基因編輯技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展迅速，新型基因編輯工具不斷被開發(fā)，尤其是CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的出現(xiàn)，使基因編輯技術(shù)進(jìn)入了新的時代。目前基因工程定點基因編輯工具中，可設(shè)計目標(biāo)序列

3、的定點核酸內(nèi)切酶主要有三種，即:ZFN（鋅指核酸酶），TALEN（轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶）和CRISPR/Cas9（規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)/CRISPR相關(guān)蛋白9）系統(tǒng)。其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)，以其設(shè)計構(gòu)建方便，敲除效率高，應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于基因編輯研究中。因此，對CRISPR/Cas9技術(shù)的改造優(yōu)化，并將其運用于構(gòu)建非人靈長類動物基因編輯模型是生命科學(xué)所迫切需要的研究內(nèi)容。
　　本文綜合運用CRISPR

4、/Cas9基因編輯系統(tǒng)，針對Nr0b1，Pparg-γ，Rag1三個基因共設(shè)計5個sgRNA，其中Nr0b1與早期性腺發(fā)育相關(guān)，Pparg-γ與脂肪代謝相關(guān)，Rag1與免疫系統(tǒng)相關(guān)。通過對食蟹猴受精卵一細(xì)胞時期顯微注射Cas9 mRNA與sgRNA的混合體系，移植入代孕猴，成功構(gòu)建定點基因敲除猴。通過對流產(chǎn)猴配子的基因鑒定，確認(rèn)CRISPR/Cas9引入的基因編輯可以傳遞于配子，提示該基因編輯可以傳遞給子代。接著，針對食蟹猴Oct4（P

5、ou5f1）基因3'UTR區(qū)設(shè)計sgRNA，并構(gòu)建同源重組質(zhì)粒5'Arm-IRES-hrGFP-3'Arm，通過對食蟹猴受精卵顯微注射Cas9 mRNA、sgRNA與供體質(zhì)粒5'Arm-IRES-hrGFP-3'Arm混合體系，移植入代孕猴，利用細(xì)胞同源重組修復(fù)機(jī)制，將外源hrGFP定點插入目的基因Oct4的3'UTR區(qū)，成功獲得定點基因敲入食蟹猴。
　　在研究基因缺陷導(dǎo)致的疾病中，除基因缺失而直接影響基因表達(dá)以外，大數(shù)據(jù)的篩查結(jié)

6、果顯示，許多單核苷酸改變的多態(tài)性或突變位點，或者短的堿基插入刪除(Indel)也與多種疾病關(guān)聯(lián)。為了很好地模擬人類疾病的這類遺傳學(xué)改變，以及模擬該類致病突變位點的修復(fù)。本文利用單拷貝BFP基因的293T細(xì)胞系作為研究工具，優(yōu)化ssODN的設(shè)計方法。針對BFP與GFP差異位點附近設(shè)計不同的ssODN和sgRNA，利用重組后細(xì)胞熒光的比例來判斷重組效率。通過綜合比較不同的設(shè)計的ssODN，以及ssODN與sgRNA的不同位置組合，發(fā)現(xiàn)利用互

7、補鏈ssODN并且突變位點位于切口位置3'方向時，重組率相對較高。隨后，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，結(jié)合單鏈寡核苷酸供體(ssODN)進(jìn)行小鼠胚胎共注射，利用ssODN作為同源重組模板，進(jìn)行同源重組修復(fù)，成功構(gòu)建了Usp42，Cep41，F(xiàn)bxo47三個定點突變小鼠模型，為非人靈長類動物模型基于ssODN的基因編輯奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)應(yīng)用于非人靈長類動物——食蟹猴，結(jié)合顯微注射技術(shù)，成功

8、構(gòu)建出定點基因編輯食蟹猴。通過對陽性流產(chǎn)猴配子的基因鑒定，提示CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生的基因編輯在食蟹猴中可以傳遞給子代。利用CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合同源重組技術(shù)，獲得了定點基因敲入食蟹猴。并利用細(xì)胞系和小鼠模型進(jìn)一步優(yōu)化了以ssODN作為同源重組模板進(jìn)行點突變模型構(gòu)建中的設(shè)計方案，根據(jù)ssODN與sgRNA相對位置的不同設(shè)計分組實驗，發(fā)現(xiàn)ssODN的設(shè)計以及與sgRNA相對位置與重組效率有關(guān)，為進(jìn)一步在靈長類模型的應(yīng)用奠定