應用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)獲得高直鏈淀粉馬鈴薯.pdf

1、馬鈴薯直鏈淀粉廣泛用于醫(yī)藥、食品等工業(yè)領域，也是生產(chǎn)抗性淀粉的重要原料。現(xiàn)有馬鈴薯品種直鏈淀粉含量僅為總淀粉含量的25％左右，且直鏈淀粉分離工序損耗大得率低。因此，創(chuàng)造培育高直鏈淀粉含量的馬鈴薯品種對于促進我國馬鈴薯淀粉加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。
　　CRISPR-Cas9技術(shù)能夠利用單鏈RNA引導Cas9蛋白酶對基因組進行定點編輯，是近年來新興的基因編輯技術(shù)，具有高效便捷、多位點同時編輯以及可剔除篩選標記等優(yōu)勢。
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2、E基因編碼馬鈴薯支鏈淀粉合成途徑的關(guān)鍵酶，具有SBEⅠ和SBEⅡ兩個亞型。本研究利用CRISPR技術(shù)敲除兩個SBE基因，以期獲得高直鏈淀粉含量的馬鈴薯新品種。試驗以SBEⅠ和SBEⅡ蛋白功能結(jié)構(gòu)域第9個外顯子20bp序列為靶標，AtU3b和AtU6-1分別啟動兩個sgRNA，CaMV35S為Cas9蛋白啟動子，構(gòu)建pYLCRISPR/Cas9-MTdi-SBEⅠ-ⅡgRNA載體。通過農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化獲得44個馬鈴薯轉(zhuǎn)化株，PCR、測序鑒定

3、獲得36個陽性轉(zhuǎn)化株。靶序列測序結(jié)果表明，有5株在SBEⅠ靶位點上出現(xiàn)突變，1株在SBEⅡ靶位點上出現(xiàn)突變，共出現(xiàn)10種突變類型，包括1bp的插入突變和2-18bp的缺失突變，最高突變率為61.9％。未檢測到同時編輯SBEⅠ和SBEⅡ兩個靶位點的馬鈴薯轉(zhuǎn)化株。測產(chǎn)結(jié)果表明，除SBEⅡ-1以外，其他轉(zhuǎn)化株的結(jié)薯數(shù)和產(chǎn)量與對照相比均無顯著變化。淀粉含量測定結(jié)果表明馬鈴薯轉(zhuǎn)化株直鏈淀粉含量均無顯著上升。
　　分析影響基因編輯效果的因素，