應(yīng)用CRISPR-Cas9技術(shù)高效構(gòu)建MLL-AF9基因融合模型.pdf

1、白血病或腫瘤的發(fā)病過(guò)程通常伴隨著融合基因的產(chǎn)生，融合基因可促進(jìn)腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展，并可作為腫瘤的分子診斷和治療靶標(biāo)。MLL-AF9基因融合在急性髓系白血?。ˋML）病人中較為常見(jiàn)，構(gòu)建MLL-AF9的細(xì)胞模型對(duì)研究AML的發(fā)病機(jī)理與藥物發(fā)現(xiàn)有很重要的意義。
　　CRISPR-Cas9是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型基因編輯技術(shù)，其構(gòu)建和使用非常方便并且成本較低，可同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行編輯，已用于構(gòu)建多種基因融合模型，但是打靶效率較低，小于1

2、0％，亟需提高其打靶效率。
　　本文提出了一種利用CRISPR-Cas9技術(shù)在體外高效構(gòu)建MLL-AF9融合基因的新策略。
　?。?）在MLL基因的第10個(gè)內(nèi)含子與AF9基因的第5個(gè)內(nèi)含子中設(shè)計(jì)并篩選出高效作用的sgRNA。
　?。?）設(shè)計(jì)一種全新的打靶載體pEASY-Blunt-MLL-GFP-AF9（2Loxp），以pEASY-Blunt作為載體，分別插入 MLL和AF9基因的同源臂序列來(lái)介導(dǎo)同源重組，并且該載體中

3、含有可敲除的GFP篩選基因。
　?。?）將高效的MLL sgRNA，AF9 sgRNA和打靶載體同時(shí)轉(zhuǎn)染人HEK293T細(xì)胞，兩條sgRNA分別在MLL和AF9基因的相應(yīng)位點(diǎn)造成切口，在打靶載體的作用下，通過(guò)同源重組使MLL基因前10個(gè)外顯子和AF9基因的第6-7個(gè)外顯子融合在一起形成新的融合基因，最后通過(guò)Cre-Loxp系統(tǒng)將GFP基因敲除。
　?。?）通過(guò)293T細(xì)胞基因組DNA的PCR及測(cè)序來(lái)鑒定發(fā)生MLL-AF9重組

4、的293T細(xì)胞，從目前結(jié)果來(lái)看重組效率可高達(dá)30%，比以前的方法有極大的提高。
　?。?）通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)觀察在293T細(xì)胞中MLL和AF9基因的狀態(tài)，但是并沒(méi)有檢測(cè)到融合基因的存在，可是由于293T細(xì)胞為多倍體，無(wú)法準(zhǔn)確的檢測(cè)到所有的染色體，可通過(guò)換一個(gè)兩倍體的細(xì)胞系來(lái)進(jìn)一步觀察。
　　本文創(chuàng)立了一種利用CRISPR-Cas9技術(shù)高效構(gòu)建基因融合的方法。從PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，設(shè)計(jì)的新的打靶載體可通過(guò)介導(dǎo)同源重組來(lái)有效地