應(yīng)用CRISPR-Cas9技術(shù)高效構(gòu)建MLL-AF9基因融合模型.pdf

1、白血病或腫瘤的發(fā)病過程通常伴隨著融合基因的產(chǎn)生，融合基因可促進腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展，并可作為腫瘤的分子診斷和治療靶標(biāo)。MLL-AF9基因融合在急性髓系白血病（AML）病人中較為常見，構(gòu)建MLL-AF9的細胞模型對研究AML的發(fā)病機理與藥物發(fā)現(xiàn)有很重要的意義。
　　CRISPR-Cas9是近年來發(fā)展起來的一種新型基因編輯技術(shù)，其構(gòu)建和使用非常方便并且成本較低，可同時對多個基因進行編輯，已用于構(gòu)建多種基因融合模型，但是打靶效率較低，小于1

2、0％，亟需提高其打靶效率。
　　本文提出了一種利用CRISPR-Cas9技術(shù)在體外高效構(gòu)建MLL-AF9融合基因的新策略。
　?。?）在MLL基因的第10個內(nèi)含子與AF9基因的第5個內(nèi)含子中設(shè)計并篩選出高效作用的sgRNA。
　?。?）設(shè)計一種全新的打靶載體pEASY-Blunt-MLL-GFP-AF9（2Loxp），以pEASY-Blunt作為載體，分別插入 MLL和AF9基因的同源臂序列來介導(dǎo)同源重組，并且該載體中

3、含有可敲除的GFP篩選基因。
　?。?）將高效的MLL sgRNA，AF9 sgRNA和打靶載體同時轉(zhuǎn)染人HEK293T細胞，兩條sgRNA分別在MLL和AF9基因的相應(yīng)位點造成切口，在打靶載體的作用下，通過同源重組使MLL基因前10個外顯子和AF9基因的第6-7個外顯子融合在一起形成新的融合基因，最后通過Cre-Loxp系統(tǒng)將GFP基因敲除。
　　（4）通過293T細胞基因組DNA的PCR及測序來鑒定發(fā)生MLL-AF9重組

4、的293T細胞，從目前結(jié)果來看重組效率可高達30%，比以前的方法有極大的提高。
　　（5）通過熒光原位雜交技術(shù)觀察在293T細胞中MLL和AF9基因的狀態(tài)，但是并沒有檢測到融合基因的存在，可是由于293T細胞為多倍體，無法準(zhǔn)確的檢測到所有的染色體，可通過換一個兩倍體的細胞系來進一步觀察。
　　本文創(chuàng)立了一種利用CRISPR-Cas9技術(shù)高效構(gòu)建基因融合的方法。從PCR實驗結(jié)果來看，設(shè)計的新的打靶載體可通過介導(dǎo)同源重組來有效地