SARS-CoV冠狀病毒M蛋白作為一類(lèi)新的胞內(nèi)病原相關(guān)分子模式上調(diào)Ⅰ型干擾素表達(dá).pdf

1、天然免疫反應(yīng)是機(jī)體抵抗外源性病原體入侵感染的第一道防線(xiàn)。天然免疫系統(tǒng)主要通過(guò)受染細(xì)胞中的模式識(shí)別受體(PRR)來(lái)識(shí)別病原體來(lái)源的病原相關(guān)分子模式(PAMP)。大部分的模式識(shí)別受體位于細(xì)胞膜或內(nèi)體膜上以識(shí)別病原體相關(guān)的RNA、DNA或者人工合成的雙鏈RNA類(lèi)似物如polyI:C，同時(shí)還有一些模式識(shí)別受體游離存在于細(xì)胞質(zhì)中，識(shí)別病毒的DNA核酸。然而，目前對(duì)于侵入細(xì)胞內(nèi)病原體所釋放出的蛋白質(zhì)是否可以作為一類(lèi)胞內(nèi)的病原相關(guān)分子模式(PAMP)

2、來(lái)發(fā)揮激活先天免疫反應(yīng)作用還不是很清楚。實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，在HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)編碼的M基因可以誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素（β干擾素）表達(dá)上調(diào)，然而具體機(jī)制并未得到深入的研究。在本論文研究中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染SARS-CoV冠狀病毒M基因可以上調(diào)HEK293T，HEK293ET以及永生化小鼠骨髓巨噬細(xì)胞J2-Mψ中IFNβ的基因表達(dá)，但在A549和Vero細(xì)胞中，M基因未能上調(diào)IFNβ啟動(dòng)子的表達(dá)水

3、平，說(shuō)明M基因上調(diào)IFNβ的現(xiàn)象可能具有組織細(xì)胞特異性。并且M基因同時(shí)激活了誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素表達(dá)的TBK1-IRF3以及NFκB信號(hào)通路。通過(guò)構(gòu)建M基因不翻譯的突變M-stop，并與正常M蛋白表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行功能比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)是M蛋白而不是M的mRNA誘導(dǎo)IFNβ的基因表達(dá)。此外，對(duì)干擾素表達(dá)通路中上游信號(hào)分子進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)M蛋白激活I(lǐng)FNβ的基因表達(dá)與TLR受體通路中的銜接蛋白MyD88，TIRAP和TICAM2相關(guān)，而并沒(méi)誘導(dǎo)激活RI

4、G-Ⅰ和MDA5介導(dǎo)的信號(hào)通路。我們還通過(guò)免疫共沉淀的方法檢測(cè)了M蛋白與TLR受體通路MyD88和TRAM銜接蛋白的相互作用，結(jié)果為陰性，說(shuō)明M蛋白可能通過(guò)間接的方式調(diào)控了TLR受體通路的銜接蛋白。由于蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)M蛋白的條帶有拖尾現(xiàn)象，我們?cè)噲D檢測(cè)M蛋白是否可能發(fā)生了泛素化修飾，通過(guò)突變其預(yù)測(cè)可能發(fā)生泛素化的賴(lài)氨酸位點(diǎn)并構(gòu)建突變進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，同時(shí)對(duì)M蛋白與HA-Ub共轉(zhuǎn)后進(jìn)行相互作用檢測(cè)，以及免疫沉淀M蛋白后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，然而我

5、們得到的都是陰性結(jié)果，說(shuō)明M蛋白在Western blotting實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的拖尾條帶不是泛素化修飾，可能發(fā)生了其他的翻譯后修飾。為進(jìn)一步分析M蛋白發(fā)揮作用是否發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，我們用蛋白分泌抑制劑brefeldinA(BFA)阻斷M蛋白由胞內(nèi)向胞外的運(yùn)輸，結(jié)果顯示加入BFA后并沒(méi)有抑制M蛋白誘導(dǎo)IFNβ的基因表達(dá)。用TLR2和TLR4受體的抑制劑阻斷可能的胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也沒(méi)有削弱M蛋白誘導(dǎo)IFNβ的基因表達(dá)，證明了M蛋白誘導(dǎo)IFNβ

6、活化的驅(qū)動(dòng)力產(chǎn)生自細(xì)胞內(nèi)部。構(gòu)建TRAF3基因的siRNA進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建，其并沒(méi)有影響M蛋白誘導(dǎo)IFNβ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)過(guò)程，因而M蛋白誘導(dǎo)IFNβ的活化過(guò)程不依賴(lài)于TRAF3信號(hào)分子。SARS-CoV冠狀病毒的假病毒感染細(xì)胞后，誘導(dǎo)IFNβ的表達(dá)上調(diào)依賴(lài)于M蛋白，M蛋白點(diǎn)突變(V68A)產(chǎn)生的假病毒并不具有誘導(dǎo)IFNβ的表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。同時(shí)，我們根據(jù)M蛋白親水區(qū)和疏水跨膜區(qū)構(gòu)建了M蛋白的缺失突變體，發(fā)現(xiàn)M蛋白的疏水跨膜區(qū)對(duì)于