HCN2基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性起搏細(xì)胞的變時(shí)性相關(guān)受體的研究.pdf

1、背景：
　　心律失常是常見(jiàn)的心血管疾病，不僅影響人們的生活質(zhì)量，而且是心臟性猝死最常見(jiàn)的原因。心臟電子起搏器植入是針對(duì)緩慢性心律失常、惡性室性心律失常的一種有效的干預(yù)措施和重要的治療方法，但從心臟的生理功能和人體適應(yīng)性的角度看，心臟電子起搏器治療仍存在非生理性起搏等問(wèn)題。用生物學(xué)方法重建具有自律性的生物活性細(xì)胞即“生物起搏器”是近年熱點(diǎn)研究課題。一些研究表明，用超極化激活的環(huán)核苷酸門(mén)控（HCN）基因家族修飾的干細(xì)胞可以產(chǎn)生超極化激

2、活的陽(yáng)離子電流（If），其中HCN2和HCN4亞型在心臟竇房結(jié)細(xì)胞中的表達(dá)最為豐富。理想的生物起搏器不僅要有自律性，還應(yīng)具有類(lèi)似竇房結(jié)起搏細(xì)胞對(duì)交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)調(diào)節(jié)作出反應(yīng)的變時(shí)性能力。然而，關(guān)于用HCN2或HCN4基因修飾的干細(xì)胞是否具有變時(shí)性能力的研究甚少。腎上腺素能受體β1（Adrb1）和膽堿能受體M2（Chrm2）作為交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)的受體，是心臟變時(shí)能力的分子基礎(chǔ)，細(xì)胞表達(dá)Adrb1和Chrm2是具備變時(shí)性能力的生物學(xué)

3、前提。
　　目的：
　　本研究探討在心肌細(xì)胞共培養(yǎng)微環(huán)境下HCN2基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）表達(dá)變時(shí)性相關(guān)受體Adrb1和Chrm2的情況。
　　方法：
　　利用基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，選用真核綠色熒光質(zhì)粒載體pEGFP-C1和小鼠的起搏基因mHCN2在體外構(gòu)建pEGFP-C1-mHCN2重組質(zhì)粒，然后導(dǎo)入BMSCs，在特定環(huán)境下誘導(dǎo)定向分化為成熟的功能細(xì)胞。選取ICR乳鼠提取原代心肌細(xì)胞在3

4、7℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，選取4周雄性ICR小鼠提取BMSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選鑒定后分為四組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，第一組為轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-mHCN2質(zhì)粒并與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)48h的BMSCs（TF+CO組），第二組為單純轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-mHCN2質(zhì)粒培養(yǎng)48h的BMSCs（TF組），第三組為單純與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)48h的BMSCs（CO組），第四組為培養(yǎng)48h未進(jìn)行任何處理的BMSCs（CTL組）。經(jīng)pEGFP-C1-mHCN2轉(zhuǎn)

5、染成功的細(xì)胞在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光。分別提取四組培養(yǎng)的BMSCs蛋白及RNA，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）來(lái)檢測(cè)mHCN2通道的表達(dá)情況及Adrb1和Chrm2相關(guān)mRNA表達(dá)情況。心肌肌鈣蛋白I（cTnI）的表達(dá)可以通過(guò)膠體金免疫層析法（GICA）測(cè)定。
　　結(jié)果：
　?、僭跓晒怙@微鏡下觀察到TF和TF+CO組BMSCs的綠色熒光，表明兩組BMSCs轉(zhuǎn)染了m

6、HCN2基因，且重組質(zhì)粒能在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。
　?、诘鞍踪|(zhì)印跡結(jié)果顯示HCN2通道蛋白在TF+CO和TF組中成功表達(dá)。
　　③CO和TF+CO組檢測(cè)到cTnI的濃度，表明兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的BMSCs可表達(dá)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物肌鈣蛋白I。
　　④TF+CO和TF兩組Adrb1和Chrm2 mRNA的表達(dá)量均高于CTL和CO組（P＜0.05），并且，TF+CO組mHCN2和Chrm2 mRNA的表達(dá)顯著高于