p90-CIP2A在乳腺癌中的免疫診斷價值及其對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、乳腺癌是女性患者中最普遍的腫瘤之一，并且在發(fā)達(dá)國家中是由于癌癥導(dǎo)致死亡的第二大原因。雖然近年來，通過影像學(xué)的檢測使乳腺癌的早期診斷有所改善，但是在許多國家中，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率仍然呈上升趨勢。因此，篩選和鑒定有價值的生物標(biāo)志物可以提高乳腺癌的診斷率以及預(yù)防乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，同時發(fā)現(xiàn)新的治療靶點對于有效地控制侵襲性乳腺癌也是極其重要的。
　　蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of prote

2、in phosphatase2A，CIP2A），也稱為KIAA1524或者p90腫瘤相關(guān)抗原，是一個新發(fā)現(xiàn)的癌蛋白。據(jù)報道，它在人類腫瘤中通過穩(wěn)定致癌性轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的表達(dá)，抑制蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase2A，PP2A）的活性。在一些惡性腫瘤細(xì)胞中，下調(diào)p90/CIP2A的表達(dá)可以降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力，并且減小異種移植腫瘤的生成。雖然p90/CIP2A在許多腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與某些腫瘤的預(yù)

3、后相關(guān)，但是目前還沒有完全揭示p90/CIP2A蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的功能和機(jī)制。
　　首先，本研究欲探討抗p90/CIP2A自身抗體是否可以作為診斷乳腺癌的生物標(biāo)志物，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）在168例乳腺癌血清和88例正常人血清中檢測抗p90/CIP2A自身抗體的陽性率。采用間接免疫熒光技術(shù)（indirect immunofluorescence a

4、ssay，IIF）測定p90/CIP2A在HEp-2細(xì)胞中的定位。其次，通過免疫組織化學(xué)實驗（immunohistochemistry， IHC）在46例乳腺癌組織和46例乳腺癌旁組織中檢測p90/CIP2A蛋白的表達(dá)。此外，本課題欲研究 p90/CIP2A在乳腺癌中的生物功能和相關(guān)機(jī)制。構(gòu)建p90/CIP2A shRNA表達(dá)載體，通過慢病毒法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩株三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和 LM2-4。然后，通過 MTT、克隆形成實

5、驗和流式細(xì)胞儀檢測p90/CIP2A對細(xì)胞增殖能力和凋亡作用的影響，并初步測定其主要信號通路的分子磷酸化水平。
　　目的:
　　1基于臨床患者和正常人群的血清和組織樣本，本研究欲探討抗p90/CIP2A抗體是否可以作為乳腺癌的免疫診斷標(biāo)志物。
　　2通過構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的 shRNA抑制 p90/CIP2A表達(dá)的體外細(xì)胞模型，檢測p90/CIP2A在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及相關(guān)機(jī)制。
　　材料與方法:
　　

6、1研究對象
　　1.1血清及組織樣本：本研究中所采用的168例乳腺癌患者血清和88例正常人血清來自美國德州大學(xué)艾爾帕索分校（University of Texas，El Paso，UTEP）腫瘤免疫研究室的血清庫。血清樣本最初由本研究的臨床醫(yī)院合作方提供，均經(jīng)病人知情同意。乳腺癌血清是在病理診斷后采集的，未經(jīng)化療或放療。對照組血清是通過同期健康體檢采集的，且沒有任何腫瘤的癥狀。本研究經(jīng)UTEP評價委員會和合作機(jī)構(gòu)同意。組織芯片購于

7、Biomax公司，包括46例乳腺癌組織和46例乳腺癌旁組織。
　　1.2細(xì)胞系：SK-BR-3、MCF10A和293T細(xì)胞購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。其他細(xì)胞系MDA-MB-231，LM2-4， T-47D和ZR-75-1由UTEP的Giulio Francia教授惠贈。
　　2方法
　　2.1通過ELISA、Western blotting和

8、IIF，檢測p90/CIP2A在乳腺癌血清和正常人血清中的免疫反應(yīng)。通過IHC，檢測p90/CIP2A在乳腺癌組織和乳腺癌旁組織中的表達(dá)。
　　2.2 shRNA慢病毒載體介導(dǎo)的p90/CIP2A基因沉默后，通過MTT、克隆形成實驗和流式細(xì)胞儀，檢測p90/CIP2A對乳腺癌細(xì)胞增殖能力和凋亡作用的影響。通過Western blotting檢測細(xì)胞中的c-Myc蛋白的表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平。
　　3統(tǒng)計分析
　　

9、使用IBM SPSS21.0統(tǒng)計軟包（SPSS Inc， USA）對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有檢驗水準(zhǔn)α=0.05。ELISA和 IHC中兩個率的比較采用χ2檢驗。采用 ROC曲線評價抗 p90/CIP2A自身抗體對乳腺癌的免疫診斷價值。MTT、克隆形成實驗和凋亡檢測中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩個獨立樣本t檢驗。
　　結(jié)果:
　　1抗p90/CIP2A自身抗體在乳腺癌病人血清中的陽性率
　　抗 p90/CIP2A自

10、身抗體在乳腺癌血清中的陽性率（19.1％）高于正常血清（2.3%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。此外，ELISA結(jié)果通過Western blotting進(jìn)一步驗證。
　　2 p90/CIP2A在HEp-2細(xì)胞中的熒光定位
　　本研究通過IIF檢測，抗p90/CIP2A自身抗體表達(dá)陽性血清的免疫熒光染色定位在胞漿。通過預(yù)吸收實驗，用純化的 p90/CIP2A蛋白與同一個血清中的抗p90/CIP2A自身抗體結(jié)合，胞漿的熒

11、光染色降低。
　　3 p90/CIP2A在乳腺癌組織中和乳腺癌旁組織中的表達(dá)
　　p90/CIP2A在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)(100%)高于乳腺癌旁組織（28%），統(tǒng)計學(xué)分析有差異（P<0.001）。
　　4 RNA干涉抑制p90/CIP2A在乳腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)模型的建立
　　本研究利用MDA-MB-231和 LM2-4兩株三陰性乳腺癌細(xì)胞作為RNA干涉抑制p90/CIP2A穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞模型。shRNA沉默p

12、90/CIP2A后，在兩株細(xì)胞中，p90/CIP2A的表達(dá)降低。
　　5在乳腺癌細(xì)胞中沉默p90/CIP2A的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞克隆形成
　　在兩株乳腺癌細(xì)胞中降低p90/CIP2A的表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，統(tǒng)計學(xué)分析有差異（P<0.05）。與MTT結(jié)果一致，抑制p90/CIP2A的表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞克隆形成能力，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。
　　6 p90/CIP2A的缺失促進(jìn)由紫杉醇誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的

13、凋亡作用
　　p90/CIP2A shRNA組中早期凋亡和晚期凋亡率的總和高于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），進(jìn)而表明在乳腺癌細(xì)胞中抑制p90/CIP2A的表達(dá)可以增強(qiáng)由紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。
　　7抑制p90/CIP2A的表達(dá)下調(diào)c-Myc的表達(dá)，且降低ERK1/2磷酸化
　　Western blotting結(jié)果顯示在兩株乳腺癌細(xì)胞系中，抑制p90/CIP2A的表達(dá)， c-Myc蛋白的表達(dá)降低，并且ERK1