HCoV-NL63 N蛋白不同片段的原核表達純化及血清學檢測應用分析.pdf

1、背景：
　　 冠狀病毒是一類單股正鏈RNA病毒[1]，屬于冠狀病毒科的冠狀病毒屬，基因組長度約為27-33kb，是RNA病毒中基因組最長的一類呼吸道病毒[2]。根據(jù)病毒的血清學特點和核苷酸序列的差異，分為三組[3]：第一第二組主要感染哺乳動物，第三組僅感染禽類。人類冠狀病毒229E、OC43是普通感冒的主要病原體之一。2003年，一種以引起嚴重急性呼吸綜合癥(severeacuterespiratorysyndrom，SARS)

2、[4]為臨床表現(xiàn)的新型冠狀病毒的爆發(fā)流行及其高致病性和高致死率引起了全世界的重新關注，隨后對于冠狀病毒的不斷深入研究，相繼又發(fā)現(xiàn)兩種新的人類冠狀病毒HCoV-NL63[5，6]和HCoV-HKU1[7]，而現(xiàn)有研究懷疑冠狀病毒可能存在未發(fā)現(xiàn)的毒株或新變異毒株，因此針對冠狀病毒的深入研究依然具有重大的公共衛(wèi)生意義。SARS的危害性，引起無數(shù)研究者的深入關注，而對目前已知的除SARS-CoV之外的其他四種冠狀病毒免疫學特征的研究，對防治SA

3、RS-CoV的再次蔓延及新型毒株的診斷、防控及治療有重大意義。
　　 研究目的:
　　 應用原核表達載體，對HCoV-NL63核衣殼蛋白N端(1-163aa)、C端(141-306aa)基因片段進行原核表達，制備相應的非融合蛋白Np、Cp及融合純化蛋白Np-SA、Cp-SA，建立WBLA方法比較HCoV-NL63全長核衣殼蛋白Nf、核衣殼蛋白N端(Np)、C端(Cp)在血清學檢測中的差別，從而建立特異、靈敏、簡易并可推廣

4、應用的HCoV-NL63血清學檢測方法與試劑。
　　 方法與結果:
　　 本研究采用pET30-a(+)原核表達系統(tǒng)，在不改變讀碼框情況下，我們利用合適的酶切位點將六個HIS加入目的基因羧基端，分別構建了攜帶有HCoV-NL63N蛋白N端(1-163aa)，C端(141-306aa)基因片段的表達質(zhì)粒pET30a-Np、pET30a-Cp、pET30a-Np-SA、pET30a-Cp-SA，將其轉化于BL21(DE3)感

5、受態(tài)細胞，通過優(yōu)化IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間等條件使得Np、Cp兩種HIS標簽蛋白均得到了可溶性表達，兩種融合蛋白均以包涵體的形式存在。Westernblot驗證目的蛋白與抗HIS抗體結合情況，結果表明四種蛋白均得到了正確表達。
　　 原核表達系統(tǒng)大量表達目的蛋白后我們通過鎳離子金屬螫合層析純化的方法得到了純度達95％以上的HIS標簽蛋白，應用Westernblot驗證純化蛋白與HCoV-NL63感染者陽性血清特異性結合情

6、況，結果顯示人類冠狀病毒NL63N蛋白N端、C端均與HCoV-NL63陽性血清有特異性結合，證明表達的蛋白具有生物活性。
　　 我們采用WBLA(Westernblotlineassay)方法利用純化的兩種非融合蛋白Np、Cp及全長N蛋白平行篩查了50份體檢血清中抗體存在情況及三種蛋白在血清學檢測中的差異，Westernblot結果顯示：HCoV-NL63人群普遍感染，50份體檢血清中，N全長蛋白(Nf)、N端(Np)、C端(C

7、p)分別檢出25、27、36份抗體陽性血清，檢出率分別為50％、54％、72％。N全長蛋白、N端一致率64％，N全長蛋白、C端一致率54％，N端、C端一致率54％。
　　 總結：
　　 本研究成功構建了HCoV-NL63N蛋白N端和C端及其與鏈親和素融合基因的原核表達質(zhì)粒并得到了相應的純化蛋白，Westernblot結果顯示四種蛋白均得到了正確表達。應用非融合純化蛋白Np、Cp檢出陽性血清，WBLA結果顯示HCoV-NL