冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白在腹主動(dòng)脈瘤中的表達(dá)及作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和研究目的
　　腹主動(dòng)脈瘤(Abdominal Aortic Aneurysm，AAA)是一種常見(jiàn)的動(dòng)脈退行性疾病，多見(jiàn)于老年人，據(jù)統(tǒng)計(jì)，腹主動(dòng)脈瘤在老年人中的發(fā)病率為5～10％，隨著年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病率逐漸增高，瘤體擴(kuò)張速度亦逐漸加快。隨著瘤體的增大，其逐漸出現(xiàn)壓迫癥狀及遠(yuǎn)端栓塞癥狀，其破裂風(fēng)險(xiǎn)亦逐漸增高，一旦發(fā)生破裂，死亡率可高達(dá)90％。因此，目前普遍認(rèn)為腹主動(dòng)脈瘤具有高致死率，其已成為嚴(yán)重威脅老年人健康的主要疾病之一。

2、
　　腹主動(dòng)脈瘤致死的主要原因是瘤體破裂出血。目前，動(dòng)脈瘤切除+人工血管置換術(shù)和腔內(nèi)覆膜支架修復(fù)術(shù)是防止腹主動(dòng)脈瘤破裂的主要手段。目前一般認(rèn)為當(dāng)瘤體最大直徑＞5.5cm時(shí)，腹主動(dòng)脈瘤瘤體破裂的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高，此時(shí)應(yīng)行手術(shù)或腔內(nèi)治療。而對(duì)于直徑＜5.5cm的小腹豐動(dòng)脈瘤，手術(shù)獲益并不能完全戰(zhàn)勝手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)長(zhǎng)期存活率亦無(wú)明顯益處，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行密切的臨床隨訪觀察。既往研究顯示，超過(guò)60％的小腹主動(dòng)脈瘤患者隨訪過(guò)程中兇瘤體增大或出現(xiàn)破裂征兆而需

3、行手術(shù)治療，但此時(shí)患者的全身狀況往往已不能耐受開(kāi)放手術(shù)治療，而腔內(nèi)覆膜支架治療對(duì)動(dòng)脈瘤的位置、形態(tài)等要求較高，腔內(nèi)治療有較大的局限性，部分患者因此而失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì);還有些病人隨訪多年，瘤體變化不大，但仍需要定期密切隨訪。因此，探明腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，尋求抑制腹主動(dòng)脈瘤進(jìn)展的藥物具有非常重要的臨床意義。
　　目前，腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病的具體機(jī)制尚未完全闡明。近年來(lái)，隨著對(duì)血管病理生理學(xué)、分子生物學(xué)等研究的深入，發(fā)現(xiàn)腹主動(dòng)脈瘤瘤

4、壁的病理改變包括平滑肌細(xì)胞減少、慢性炎癥及細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix， ECM)的過(guò)度降解與重塑等改變。而既往研究表明，瘤壁的慢性炎癥參與腹主動(dòng)脈瘤的形成、進(jìn)展及破裂的整個(gè)過(guò)程，是腹主動(dòng)脈瘤重要的病理學(xué)特征之一。一方面，瘤壁浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞可分泌大量的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、單核巨噬細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)等多種炎癥因子，引起瘤壁的損傷，同

5、時(shí)其所分泌的炎癥因子又可進(jìn)一步趨化炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)一步加重瘤壁的損傷。另一方面，瘤壁浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)可分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMPs)等蛋白水解酶，而MMPs能夠引起管壁彈力纖維等的降解，加劇瘤體的擴(kuò)張。因此，瘤壁的慢性炎癥是腹主動(dòng)脈瘤形成、進(jìn)展的重要因素之一。
　　冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(Cold-inducible RNA binding prot

6、ein， CIRP)是一種RNA結(jié)合蛋白，屬于冷休克蛋白家族成員，廣泛表達(dá)于多種組織，正常細(xì)胞呈低表達(dá)狀態(tài)，而多種應(yīng)激如低體溫、缺氧、紫外線、H2O2等可上調(diào)CIRP的表達(dá)。既往研究表明，細(xì)胞在應(yīng)激壓力下，CIRP從細(xì)胞核轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)穩(wěn)定某些細(xì)胞生存所必須物質(zhì)mRNA的表達(dá)，進(jìn)而幫助細(xì)胞度過(guò)應(yīng)激壓力。然而，近年來(lái)的許多研究表明，CIRP可被分泌到細(xì)胞外，參與多種疾病的炎癥損傷，如失血性休克、膿毒血癥、肝缺血再灌注損傷、腦缺

7、血再灌注損傷等。CIRP作為內(nèi)源性致炎因子可直接上調(diào)TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)，引發(fā)炎癥的瀑布式反應(yīng)，加重組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，CIRP在心、腦、肝、腎、肺、腸道及皮膚等組織的炎癥反應(yīng)過(guò)程中呈高表達(dá)狀態(tài)，而且以CIRP為靶點(diǎn)的治療措施可明顯減輕組織損傷。但對(duì)于CIRP在腹主動(dòng)脈瘤瘤壁炎癥反應(yīng)過(guò)程中的表達(dá)及作用，目前尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。我們將在本研究中對(duì)CIRP在腹主動(dòng)脈瘤中的表達(dá)及其在瘤壁炎癥反應(yīng)過(guò)程中的作用進(jìn)行探索。
　

8、　彈力蛋白酶腔內(nèi)灌注誘導(dǎo)腹主動(dòng)脈瘤模型是通過(guò)灌注管向腹主動(dòng)脈腔內(nèi)高壓灌注豬Ⅰ型彈力蛋白酶，使彈力蛋白酶溶液充分浸潤(rùn)到管壁各層，高壓灌注后即刻出現(xiàn)腹主動(dòng)脈灌注段的輕度擴(kuò)張，隨后引發(fā)管壁彈力纖維逐漸破壞，動(dòng)脈壁出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，灌注段腹主動(dòng)脈逐漸擴(kuò)張成瘤。彈力蛋白酶腔內(nèi)灌注模型是目前應(yīng)用較多的腹主動(dòng)脈瘤模型之一，可在一定程度上模擬臨床腹主動(dòng)脈瘤的某些病理特征。由于該模型的瘤壁炎癥反應(yīng)明顯，符合本研究的研究目的

9、，而且該模型穩(wěn)定、大鼠手術(shù)操作簡(jiǎn)便。因此，我們將采用彈力蛋白酶腔內(nèi)灌注大鼠腹主動(dòng)脈瘤模型進(jìn)行CIRP在腹主動(dòng)脈瘤瘤壁炎癥反應(yīng)過(guò)程中作用的研究。
　　本研究將通過(guò)檢測(cè)腹主動(dòng)脈瘤患者血清及瘤壁組織中CIRP的表達(dá)情況及其與瘤壁炎癥的關(guān)系，并通過(guò)大鼠腹主動(dòng)脈瘤模型研究CIRP在瘤壁炎癥反應(yīng)過(guò)程及腹主動(dòng)脈瘤形成過(guò)程中的具體作用，并通過(guò)細(xì)胞學(xué)研究進(jìn)一步探索其作用機(jī)制。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡明瘤壁炎癥反應(yīng)在腹主動(dòng)脈瘤進(jìn)展過(guò)程的作用，并為臨床腹主動(dòng)

10、脈瘤的治療提供理論依據(jù)及新的線索。
　　研究?jī)?nèi)容
　　第一部分:探索CIRP在腹主動(dòng)脈瘤患者血清及瘤壁組織中的表達(dá)，并探索血清CIRP與瘤壁炎癥的相關(guān)性。
　　第二部分:探索CIRP在大鼠腹主動(dòng)脈瘤模型中的表達(dá)，并進(jìn)一步明確抗CIRP抗體對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈瘤的治療作用。
　　第三部分:探索CIRP在大鼠腹主動(dòng)脈瘤瘤壁炎癥及腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。
　　研究方法
　　第一部分:
　　1.收集

11、2014年1月～2015年6月期間于山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院血管外科行腹主動(dòng)脈瘤切除+人工血管置換術(shù)的腹主動(dòng)脈瘤患者血清及瘤壁組織共計(jì)8例，以及8例健康體檢(未發(fā)現(xiàn)腹主動(dòng)脈瘤)的成人血清和8例多器官捐獻(xiàn)者(器官捐獻(xiàn)時(shí)未發(fā)現(xiàn)腹主動(dòng)脈瘤)于山東省立醫(yī)院行腎臟、肝臟移植時(shí)殘留的部分正常腹主動(dòng)脈組織。
　　2.通過(guò)ELISA、Western blot技術(shù)檢測(cè)血清中CIRP的表達(dá)，通過(guò)RT-PCR、Westernblot檢測(cè)瘤壁CIRP的表

12、達(dá)，并通過(guò)免疫組化檢測(cè)CIRP的表達(dá)位置，通過(guò)免疫熒光雙染色技術(shù)檢測(cè)CIRP的細(xì)胞來(lái)源。
　　3.采用Spearson相關(guān)系數(shù)判定血清CIRP濃度與瘤壁炎癥因子表達(dá)的相關(guān)性。
　　第二部分:
　　1.大鼠腹主動(dòng)脈瘤模型的建立及分組:將雄性Wistar大鼠分為假手術(shù)組和腹主動(dòng)脈瘤模型組。利用4-0慕絲線阻斷腹主動(dòng)脈近心端及遠(yuǎn)心端血流，30G的注射器針頭穿刺腹主動(dòng)脈前壁，置入PPE-10管，然后采用腔內(nèi)灌注彈力蛋白酶溶液，

13、術(shù)后給予B超檢測(cè)、HE及EVG染色判定造模是否成功。
　　2.RT-PCR、Western blot、免疫組化及免疫熒光檢測(cè)大鼠腹主動(dòng)脈瘤模型中CIRP的表達(dá)。
　　3.抗CIRP抗體治療實(shí)驗(yàn)分組:將腹主動(dòng)脈瘤模型大鼠隨機(jī)分為無(wú)免疫活性IgG治療組和抗CIRP抗體治療組，分別于術(shù)后24小時(shí)或術(shù)后2周開(kāi)始給予相應(yīng)治療。
　　4.HE、EVG染色、RT-PCR、Western blot及明膠酶譜等技術(shù)檢測(cè)抗CIRP抗體治療

14、對(duì)瘤壁的保護(hù)作用。
　　第三部分:
　　1.RT-PCR、Western blot、明膠酶譜及免疫組化等技術(shù)檢測(cè)抗CIRP抗體治療后大鼠腹主動(dòng)脈瘤瘤壁TLR4/NF-κB信號(hào)通路及炎癥反應(yīng)的變化。
　　2.rmCIRP刺激實(shí)驗(yàn)分組:將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW264.7巨噬細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組，rmCIRP處理組和rmCIRP+抗CIRP抗體共同處理組。
　　3.RT-PCR、Western blot檢測(cè)rmCIRP

15、處理后RAW264.7巨噬細(xì)胞MMP-9的表達(dá)變化。
　　4.明膠酶譜技術(shù)檢測(cè)rmCIRP處理后RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液MMP-9的活性變化。
　　5.Transwell小室檢測(cè)rmCIRP對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞遷移能力的影響。6.RT-PCR、Western blot檢測(cè)rmCIRP處理后RAW264.7巨噬細(xì)胞TLR4/NF-κB炎性通路的激活情況。
　　研究結(jié)果
　　第一部分:
　　1.人體

16、腹主動(dòng)脈瘤瘤壁的基本檢測(cè)情況:HE及EVG染色顯示腹主動(dòng)脈瘤瘤壁組織可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、彈力纖維破壞等基本病理變化。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)瘤壁炎性因子TNF-α、HMGB1及TLR4 mRNA表達(dá)水平均明顯升高。RT-PCR、Western blot及明膠酶譜技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)瘤壁組織MMP-2/9的表達(dá)及活性均明顯升高。
　　2.CIRP在腹主動(dòng)脈瘤患者中的表達(dá)情況: ELISA及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腹主動(dòng)脈瘤患者血清中C

17、IRP的表達(dá)明顯升高。RT-PCR及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)瘤壁組織CIRP的表達(dá)明顯升高，同時(shí)免疫組化染色顯示瘤壁CIRP不僅表達(dá)于細(xì)胞核、細(xì)胞漿，還部分彌散至細(xì)胞外。同時(shí)，免疫熒光雙染色顯示瘤壁CIRP表達(dá)于殘存的平滑肌細(xì)胞及浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞。
　　3.血清CIRP與瘤壁炎癥的相關(guān)性:Spearson分析顯示血清CIRP濃度與瘤壁炎性因子TNF-α的表達(dá)呈正相關(guān)(P=0.038 R=0.736)。
　　第二部分:<

18、br>　　1.造模情況:大鼠腹主動(dòng)脈瘤造模4周后行超聲檢測(cè)，結(jié)果顯示瘤體最大直徑均超過(guò)術(shù)前直徑的50％，從腹主動(dòng)脈直徑變化方面表明大鼠腹主動(dòng)脈瘤模型制作成功;瘤壁HE染色顯示瘤壁組織的3層結(jié)構(gòu)紊亂，其內(nèi)膜、中膜及外膜組織被大量破壞，中膜的平滑肌細(xì)胞排列紊亂、數(shù)量減少、成纖維細(xì)胞明顯增多，各層可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn);同時(shí)，EVG染色顯示瘤壁彈力纖維被大量破壞。
　　2.大鼠腹主動(dòng)脈瘤模型CIRP表達(dá)情況:RT-PCR、Western

19、 blot技術(shù)檢測(cè)瘤壁組織CIRP的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，模型血清及瘤壁組織CIRP的表達(dá)水平均較假手術(shù)組明顯升高。免疫組化染色顯示模型組CIRP染色于細(xì)胞核、細(xì)胞漿及細(xì)胞間隙均可見(jiàn)表達(dá)。同時(shí)，免疫熒光雙染色發(fā)現(xiàn)瘤壁組織CIRP表達(dá)于殘存的平滑肌細(xì)胞及浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞。
　　3.抗CIRP抗體對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈瘤的治療情況:大鼠腹主動(dòng)脈瘤模型抗CIRP抗體治療后，B超檢測(cè)顯示，治療組最大直徑較模型對(duì)照組明顯縮小。術(shù)后4周瘤壁組織EVG染色

20、顯示，治療組瘤壁組織彈力纖維的破壞程度較模型對(duì)照組明顯減輕，治療組瘤壁組織可見(jiàn)部分彈力纖維殘留。RT-PCR、Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，治療組瘤壁組織MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)水平均較模型對(duì)照組明顯降低;同時(shí)，明膠酶譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)治療組瘤壁組織MMP-2、MMP-9的活性亦得到明顯抑制。
　　第三部分:
　　1.抗CIRP抗體治療對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈瘤瘤壁TLR4/NF-κB信號(hào)通路及炎癥反應(yīng)的影響:大鼠腹主動(dòng)

21、脈瘤模型抗CIRP抗體治療后，RT-PCR、Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，治療組瘤壁組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路與模型對(duì)照組相比明顯被抑制。同時(shí)，RT-PCR、Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)治療組瘤壁組織MCP-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均較模型對(duì)照組明顯降低;而瘤壁CD68染色也顯示治療組瘤壁組織巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度較模型對(duì)照組明顯減輕。
　　2.rmCIRP刺激對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞遷移能力的影響:rmCIRP處理

22、后Transwell小室檢測(cè)發(fā)現(xiàn)rmCIRP蛋白可增加RAW264.7細(xì)胞向小室底部遷移的數(shù)量，而該作用可被抗CIRP抗體所阻斷。
　　3.rmCIRP刺激對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞TLR4/NF-κB炎性通路的影響:rmCIRP處理后，RT-PCR、Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，rmCIRP蛋白可明顯上調(diào)RAW264.7細(xì)胞TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)水平;同時(shí)，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，rmCIRP蛋白可明顯上調(diào)細(xì)

23、胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)，表明rmCIRP蛋白可促進(jìn)NF-κB入核。
　　4.rmCIRP刺激對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞MMP-9表達(dá)及活性的影響:rmCIRP處理后，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示低濃度rmCIRP不能明顯上調(diào)RAW264.7細(xì)胞MMP-9 mRNA的表達(dá)，但高濃度rmCIRP可明顯上調(diào)MMP-9 mRNA的表達(dá)，即:rmCIRP蛋白上調(diào)MMP-9 mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)濃度依懶性。同時(shí)，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，r

24、mCIRP蛋白可明顯上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9蛋白的表達(dá)水平，但該作用可被抗CIRP抗體所阻斷。明膠酶譜法檢測(cè)rmCIRP處理后RAW264.7細(xì)胞上清液中MMP-9的活性，結(jié)果顯示rmCIRP可明顯上調(diào)巨噬細(xì)胞所分泌MMP-9的活性，但該作用同樣可被抗CIRP抗體所阻斷。
　　結(jié)論
　　1.CIRP在人體腹主動(dòng)脈瘤的血清及瘤壁組織中存在異常高表達(dá)，而相關(guān)性分析顯示，血清CIRP濃度與瘤壁炎性因子的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　2.