DEC流行特征分析及stx基因快速檢測方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　致瀉性大腸埃希菌(Diarrheagenic Escherichia coli, DEC)依其攜帶的毒力基因及致病性一般可分為腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、腸出血性大腸埃希菌(EHEC)或產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌，STEC)、產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌(ETEC)、腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)、和腸集聚性大腸埃希菌(EAEC)以及彌散黏附性大腸埃希菌(DAEC)。目前，除DAEC外，其它各類的DEC在全球流行甚至暴發(fā)的事件多

2、有報道。2011年3月至7月，德國暴發(fā)大規(guī)模的由DEC O104∶H4引起胃腸炎和溶血性尿毒綜合征疫情，事件波及歐洲16個國家，共4125人發(fā)病，892例患者發(fā)生HUS，50人死亡，為迄今為止暴發(fā)的最嚴(yán)重的一次非O157 STEC疫情，此次疫情的罪魁禍?zhǔn)诪閟tx基因編碼的Stx，可引起HUS，甚至死亡。文獻(xiàn)報道多種細(xì)菌可攜帶stx基因。因此本次疫情給全球一個強(qiáng)有力的警示。杭州獨(dú)特的地理位置、水域環(huán)境及旅游特色，歷來是腹瀉的高發(fā)城市，因此

3、我們必須加強(qiáng)對DEC的監(jiān)測及防治研究，掌握其流行特征及應(yīng)對措施，建立快速、準(zhǔn)確的stx基因檢測方法，能及時向臨床醫(yī)生報告結(jié)果以便其指定后續(xù)治療方案，這對DEC或攜帶stx細(xì)菌疫情的預(yù)警及有效防止均有重要意義。
　　方法：
　　1、收集2014年浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診及腸道門診的急性腹瀉糞便標(biāo)本，分別采用常規(guī)微生物檢驗(yàn)程序及RT-PCR等方法對主要腸道致病菌及病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)及檢測;
　　2、采用多重PCR的方法對保存

4、的大腸埃希菌進(jìn)行鑒定及分型;
　　3、統(tǒng)計(jì)分析2011-2014年在浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診及腸道門診收集的急性腹瀉患者資料及DEC檢測數(shù)據(jù);
　　4、建立快速檢測stx1、stx2單、雙重?zé)晒舛縋CR方法;
　　5、采用熒光PCR方法對收集自腸道內(nèi)外的可疑臨床菌株及急性腹瀉標(biāo)本進(jìn)行檢測，陽性結(jié)果送出測序，進(jìn)而進(jìn)行序列比對及分析。
　　結(jié)果：
　　1、對2014年735份急性腹瀉標(biāo)本通過分離、培養(yǎng)、核酸檢

5、測、免疫學(xué)檢測等方法展開病原體篩查，其中陽性標(biāo)本（至少檢出1種細(xì)菌、真菌、病毒）338份，陽性檢出率為45.99％。其中致瀉性大腸埃希菌144份，檢出率為19.59％，列急性腹瀉病原首位，其次是諾如病毒和副溶血弧菌。
　　2、在2014年735份急性腹瀉標(biāo)本中，同時檢出兩種或兩種以上病原標(biāo)本11份，其中有1份標(biāo)本同時檢出3種腹瀉病原。
　　3、采用多重PCR方法對2014年735例急性腹瀉標(biāo)本進(jìn)行DEC鑒定，共檢出144株D

6、EC，檢出率為19.59％(144/735)。其中，EAEC73株，檢出率為9.93％(73/735); ETEC32株，檢出率為4.35％(32/735); EPEC20株，其檢出率為2.72％(20/735);分離到EIEC及STEC兩型DEC各2株，其檢出率均為0.27％(2/735)。此外，在分離到的DEC中，有15株菌同時攜帶EAEC、ETEC及EPEC的毒力基因。在分離到的DEC中，以EAEC為主，占50.69％(73/14

7、4)，其次為分別為ETEC(22.22％)和EPEC(13.89％)。
　　4、DEC一年四季均可分離到，主要以夏秋季為主，通過數(shù)據(jù)分析，2011、2012、2013年的檢出率存在季節(jié)差異（P分別為0.027、0.025和0.016），但是2014年的檢測數(shù)據(jù)顯示其四季檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其中EAEC/ETEC的檢出率夏秋季最高，存在季節(jié)性差異，P=0.025、0.001(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他各型DEC檢出率均無季

8、節(jié)性差異。
　　5、男性和女性患者的DEC檢出率分別為21.69％、17.87％，其差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無意義。其中ETEC/EAEC的男、女檢出率分別為2.41％、0.50％，P=0.049(P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，統(tǒng)計(jì)分析2011、2012及2013年監(jiān)測數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示DEC及其各型在性別分布方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6、2014年期間DEC主要在19-60歲年齡段急性腹瀉患者中檢出，占77.78％(112/14

9、4)，其次為＞60歲年齡段，占16.67％;但不同年齡段急性腹瀉患者DEC及其各型DEC檢出率并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與2014年一樣，2011、2012、2013年杭州部分地區(qū)DEC也主要在19-60歲年齡段急性腹瀉患者中檢出，除2012年外，DEC及其各型檢出率在不同年齡段不存在差異。2012年DEC檢出率以＞60歲年齡段最高(20.43％)，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P=0.024(P＜0.05)。
　　7、2014年分離到DEC的急性腹瀉

10、患者多為水樣便，占78.47％(113/144)，其次為米泔樣便(13.89％);但DEC檢出率最高的糞便性狀為米泔樣便混有粘液便及鮮血便，均為50％，其次為水樣便加鮮血便，檢出率為33.33％，但是DEC及各型檢出率在各性狀糞便間無顯著差異。2011年DEC多在急性腹瀉患者水樣便中檢出，占63.30％（69/109）;2012年主要在粘液樣變和水樣便中檢出,分為占46.60％(48/103)、40.78％(42/103);2013年則

11、多在爛糊便和水樣便中檢出，各為28.81％(34/118)和21.19％(25/118)。且2011年DEC、EAEC、ETEC和EPEC檢出率在各糞便性狀組中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，2012年、2013年為DEC和EAEC檢出率存在差異。此外，糞便中存有白細(xì)胞的各分組間DEC檢出率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，糞便中存在紅細(xì)胞的各分組間EAEC檢出率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　8.2013、2014年檢出的部分DEC菌株攜帶多型別毒力基因，分別為40株和15株

12、，2013年40株DEC攜帶毒力基因情況如下，astA+estⅠb24株、astA+escV6株、astA+elt+estⅠb2株， astA+elt、 astA+elt+ estⅠa、 astA+ elt+ estⅠb+pic、astA+estⅠb+escV、stA+ estⅠb、astA+ elt+ estⅠa+ escV、invE+escV、elt+ escV均為1株。2014年的15株DEC分別攜帶aggR+escV1株、 as

13、tA+escV1株、pic+bfpB1株、astA+elt1株、astA+estⅠa2株、astA+estⅠa7株、astA+estⅠb+escV1株、bfpB+stx21株。
　　9.建立的快速檢測stx基因的單、雙重?zé)晒釶CR方法特異性較好，與腸道分離的其他細(xì)菌、真菌不存在交叉反應(yīng);檢測范圍為1×103～1×102copies/ml;在室溫中的穩(wěn)定性好，放置7天無明顯影響;在重復(fù)性方面批間、批內(nèi)變異系數(shù)均小于10％。
　

14、　10.用所建立的雙重?zé)晒釶CR方法檢測臨床菌株，其中有4株大腸埃希菌stx陽性，2株stx1陽性，2株stx2陽性。
　　11.用所建立的雙重?zé)晒釶CR方法直接檢測急性腹瀉標(biāo)本，在抽取的55份標(biāo)本中檢出8份陽性。
　　結(jié)論：
　　1、杭州地區(qū)急性腹瀉患者DEC檢出率高，列急性腹瀉常見病原體首位，其中EAEC為本地區(qū)的主要流行類型，其次依次是ETEC、EPEC、EIEC和STEC。
　　2、DEC在季節(jié)和糞便性狀