安徽地區(qū)PEDVS基因序列分析及間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種高度接觸性腸道傳染病。該病在1971年首次報道于英國，1976年我國也證實了本病。目前，PED已經(jīng)成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)最為嚴重的病毒性傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。近幾年，我國PED的發(fā)病率、死亡率均呈上升趨勢，尤其是自2010年10月以來，PED在我

2、國的流行廣泛并呈現(xiàn)新的特點。感染PEDV后，哺乳仔豬死亡率達80％?100%，而繁殖母豬和公豬則很少表現(xiàn)出臨床癥狀。病毒的變異可能是引起PED大規(guī)模爆發(fā)的原因，這給本病的防治帶來了新的挑戰(zhàn)。因此對于PEDV基因遺傳進化的分析以及建立一種快速、可靠的PEDV抗體檢測方法，進行PED流行病學(xué)的監(jiān)測以及豬群免疫過PED疫苗后抗體水平的檢測，對于本病的預(yù)防具有重要意義。本研究內(nèi)容包括以下部分:
　　1：安徽地區(qū)PEDV S基因遺傳進化分析

3、
　　為分析2014?2015年安徽地區(qū)豬流行性病毒（PEDV）的變異情況，本研究設(shè)計合成3對特異性引物，對2014?2015年采集自安徽省12個地級市21個不同地區(qū)發(fā)生腹瀉的豬場，經(jīng)檢測為PEDV陽性的病料，對這21株P(guān)EDV毒株的S基因全基因序列測序，并對其進行遺傳進化分析。結(jié)果表明，21株P(guān)EDV安徽地區(qū)毒株除AHBB-1外，20株P(guān)EDV安徽地區(qū)毒株S基因全長均為4161bp。21株P(guān)EDV S基因核苷酸和氨基酸的同源性分

4、別為96.3%?99.9%和96.0%?99.8%；與經(jīng)典CV777株核苷酸和氨基酸同源性分別為93.7%?95.9%和92.6%?96.8%。21株安徽毒株除AHBB-1株外，其他20株S基因均存在相同的插入和缺失,這些位點核苷酸的插入和缺失導(dǎo)致了其編碼的氨基酸相應(yīng)改變。S基因系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，21株安徽毒株除 AHBB-1外20株處于同一分支，且與2011?2012年的6株中國其它地區(qū)毒株、2014年的2株中國其他地區(qū)毒株、2

5、005?2009年3株韓國毒株親緣關(guān)系均較密切，而與歐洲株（CV777、Brl）、中國現(xiàn)用疫苗株(CV777-vaccine)及中國早期分離株CH/S親緣關(guān)系均較遠。S蛋白抗原位點分析表明，安徽分離株與現(xiàn)用疫苗株（CV777-vaccine）相比，流行毒株S蛋白的主要抗原位點及COE區(qū)域均發(fā)生了變異。
　　2.間接ELISA檢測方法的建立
　　利用生物學(xué)軟件分析PEDV S蛋白抗原位點，選擇編碼親水性較強、抗原指數(shù)較高且表面

6、可及性好的區(qū)域，針對這個區(qū)域設(shè)計一對特異性引物，以PEDV基因組反轉(zhuǎn)錄后cDNA為模板進行擴增，擴增產(chǎn)物回收、純化后克隆至原核表達載體pET-32a（+）中，構(gòu)建原核表達重組載體pET-32a-S，經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達菌BL21中進行誘導(dǎo)表達，以SDS-PAGE蛋白電泳鑒定是否表達及表達形式；以Western-blot鑒定重組蛋白的免疫活性。摸索重組S蛋白的最佳表達條件，對重組蛋白S進行純化，用純化后的S蛋白作為包被物，建立PEDV抗體

7、間接ELISA檢測方法，并與進口商品化PEDV抗體試劑盒和Western-blot金標準進行對比試驗，比較二者的符合率、敏感性和特異性。結(jié)果表明：本研究成功擴增出所需S基因片段并構(gòu)建重組載體pET-32a-S，誘導(dǎo)表達出重組S蛋白，經(jīng)Western-blot分析驗證具有良好的反應(yīng)原性。通過對建立間接ELISA檢測方法的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)的最佳蛋白包被濃度為8mg/L，封閉液為2%BSA，一抗的最佳稀釋度為1:40，最佳作用時間為30mi

8、n，羊抗豬IgG-HRP最佳稀釋度1:1500稀釋，最佳作用時間為45min，顯色時間為10min。重復(fù)試驗表明組內(nèi)及組間變異系數(shù)均小于10%，重復(fù)性較好。與進口商品化 PEDV抗體檢測試劑盒相比符合率、敏感性和特異性為86.67%、89.83%、82.62%；與western-blot檢測結(jié)果相比，符合率、敏感性和特異性88.89%、90.20%、83.33%。結(jié)果表明：以表達的重組S蛋白為包被抗原建立的間接ELISA檢測方法特異性高