棉花體細(xì)胞胚發(fā)生蛋白組學(xué)分析和GhTZF1基因功能鑒定.pdf

1、活性氧既能作為代謝副產(chǎn)物對植物造成氧化傷害，又能作為信號分子調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)等過程?；钚匝醯碾p重作用取決于胞內(nèi)活性氧的水平。植物體具有一套嚴(yán)格的活性氧產(chǎn)生和清除系統(tǒng)調(diào)控著胞內(nèi)的活性氧穩(wěn)態(tài)平衡。在正常的生長發(fā)育過程中，植物體內(nèi)活性氧的水平處于穩(wěn)態(tài)平衡，但是，一些逆境因子能打破活性氧的穩(wěn)態(tài)平衡，對植物造成氧化脅迫。植物體內(nèi)活性氧的穩(wěn)態(tài)對植物正常的生理代謝過程具有重要的作用。
　　1.活性氧穩(wěn)態(tài)通過生長素信號路徑調(diào)控棉花體細(xì)胞

2、胚發(fā)生
　　體細(xì)胞胚發(fā)生是體細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變，經(jīng)歷與合子胚發(fā)育相似的階段，最終再生成完整植株的過程。體胚發(fā)生不僅是研究合子胚胎發(fā)育的良好模型，也是植物遺傳轉(zhuǎn)化、植株再生的有效體系。為了闡明體胚發(fā)生過程中復(fù)雜的分子事件以及控制體胚發(fā)生的因子，我們通過蛋白組學(xué)結(jié)合MADI-TOF/TOF方法，來發(fā)掘調(diào)控棉花體胚發(fā)生的相關(guān)蛋白，并探索其可能存在的分子調(diào)控機(jī)制。通過雙向電泳和質(zhì)譜鑒定，我們比較了棉花體胚發(fā)生過程中具有代表性的時間點(diǎn)/階段

3、(0 h，2d，NEC，EC，GE，TE，CE)的蛋白質(zhì)組。與起始時期0h相比，我們鑒定了149個差異表達(dá)的蛋白。GO分析表明，這些差異表達(dá)的蛋白主要參與胞內(nèi)代謝、刺激響應(yīng)以及生長發(fā)育和生殖等過程。一些逆境相關(guān)蛋白在棉花體胚發(fā)生過程中被激活且差異表達(dá)，主要包括一些活性氧清除相關(guān)的酶，如APX、GST、SOD和硫氧還蛋白等。qRT-PCR分析表明，大部分編碼活性氧清除相關(guān)蛋白的基因，其在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平具有一致的表達(dá)模式。我們對部分編碼

4、活性氧清除相關(guān)蛋白的基因進(jìn)行干涉表達(dá)，以驗證這些蛋白在棉花體胚發(fā)生中的作用。將GhAPXs在棉花中干涉表達(dá)后，GhAPXs干涉系中的過氧化氫含量顯著高于野生型，GhAPXs干涉系的體胚發(fā)生起始和脫分化過程被顯著抑制，而胚性細(xì)胞再分化過程被促進(jìn)。同樣，在棉花中干涉GhGSTL3表達(dá)后，GhGSTL3干涉系中的過氧化氫含量高于野生型，GhGSTL3干涉系的體胚發(fā)生起始和脫分化過程與野生型相比無明顯差異，但是GhGSTL3干涉系的再分化過程顯

5、著提前。上述結(jié)果表明，這些基因可能通過調(diào)控活性氧穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而參與棉花體胚發(fā)生的調(diào)控。我們進(jìn)一步通過外源添加高濃度DPI、H2O2、BSO和GSH等化學(xué)物質(zhì)，以改變內(nèi)源氧化還原穩(wěn)態(tài)，來觀察氧化還原穩(wěn)態(tài)對體胚發(fā)生的影響。結(jié)果表明，氧化還原穩(wěn)態(tài)破壞抑制了體細(xì)胞脫分化過程，而氧化環(huán)境則促進(jìn)了胚性愈傷向體胚的轉(zhuǎn)變，進(jìn)一步證實了活性氧穩(wěn)態(tài)參與了棉花體胚發(fā)生的調(diào)控。DPI和過氧化氫處理均導(dǎo)致了自由態(tài)生長素含量降低、生長素代謝改變以及生長素運(yùn)輸和響應(yīng)相關(guān)

6、基因的激活。抑制GhAPXs表達(dá)，同樣導(dǎo)致了體胚發(fā)生過程中生長素代謝改變，并且，生長素運(yùn)輸和響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)與野生型相比也發(fā)生改變。這個結(jié)果顯示，無論是通過化學(xué)試劑還是通過抑制活性氧清除相關(guān)蛋白的表達(dá)來改變體內(nèi)活性氧穩(wěn)態(tài)，均會改變體胚發(fā)生過程中的生長素穩(wěn)態(tài)平衡。我們的研究表明，體胚發(fā)生激活了逆境相關(guān)基因的表達(dá)，并通過活性氧穩(wěn)態(tài)和生長素信號路徑動態(tài)互作來調(diào)控棉花體胚發(fā)生。
　　2.GhTZF1通過抑制活性氧的積累來增強(qiáng)植株的耐旱性

7、和延緩葉片衰老
　　氧化還原穩(wěn)態(tài)對植物維持胞內(nèi)代謝至關(guān)重要。胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的打破會導(dǎo)致細(xì)胞遭受氧化傷害進(jìn)而抑制植物的生長發(fā)育。在細(xì)胞壁再生SSH文庫中，我們分離得到一個CCCH型串聯(lián)鋅指蛋白基因。通過RACE的方法，我們獲得該基因的全長，并通過結(jié)構(gòu)分析和聚類分析發(fā)現(xiàn)，該基因具有植物特有的保守鋅指結(jié)構(gòu)域TZF，因而將該基因命名為GhTZF1。表達(dá)模式分析表明，GhTZF1在細(xì)胞壁再生的早期階段優(yōu)勢表達(dá)。組織表達(dá)模式分析表明，GhT

8、ZF1在營養(yǎng)器官和生殖器官中均有表達(dá)，且受葉片衰老誘導(dǎo)表達(dá)。此外，GhTZF1受多種非生物逆境誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，如PEG和NaCl等，GhTZF1同樣受茉莉酸甲酯和過氧化氫的誘導(dǎo)表達(dá)。在擬南芥中超表達(dá)GhTZF1，增強(qiáng)了植株的耐旱性并延緩了干旱誘導(dǎo)的葉片衰老。進(jìn)一步的實驗表明，超表達(dá)GhTZF1同樣能延緩黑暗和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的葉片衰老。在干旱和茉莉酸甲酯處理下，超表達(dá)系中過氧化氫的含量均顯著低于野生型。與此一致，在干旱處理條件下，活性氧清除