家蠶馬氏管蛋白組學(xué)及重要酶類的功能分析.pdf

1、屬于鱗翅目昆蟲(chóng)的家蠶，體內(nèi)物質(zhì)的代謝的重要器官-馬氏管與其他昆蟲(chóng)的馬氏管(腎管)乃至哺乳動(dòng)物的腎臟有著很大的相關(guān)性，也具有其獨(dú)特的特征。對(duì)于家蠶馬氏管重要功能性蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和研究可以為我們更好地理解昆蟲(chóng)馬氏管(腎管)的功能，在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，因?yàn)椴煌倪M(jìn)化需要，昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物共有和不同的進(jìn)化結(jié)果。另外，作為能夠大量吐絲結(jié)繭的昆蟲(chóng)，家蠶的巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值已長(zhǎng)久被人們所關(guān)注。代謝作為消化過(guò)程后的必要環(huán)節(jié)，其與家蠶生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)作用不容忽視。因

2、此，對(duì)于家蠶馬氏管的研究對(duì)于提高家蠶體質(zhì)，進(jìn)而提高產(chǎn)絲效率和產(chǎn)絲量可以起到一個(gè)很好推動(dòng)作用。而且，家蠶馬氏管具有顯著區(qū)段特征的特殊構(gòu)造對(duì)于研究馬氏管(腎管)不同區(qū)段的功能提供了很好的條件。
　　 本研究利用丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)合液相質(zhì)譜(LC MS/MS)、雙向電泳(2D)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜(2D-MALDI-TOF/MS)的方法分析了家蠶五齡第5天馬氏管的主要表達(dá)蛋白質(zhì)；并對(duì)五齡第5天的各段馬氏管、五齡

3、第5天與化蛹第1天整段馬氏管的表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行了比較；還對(duì)蛾期馬氏管代謝產(chǎn)物中存在的主要蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定；利用家蠶的基因組序列、表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)數(shù)據(jù)以及基因芯片數(shù)據(jù)，對(duì)具有顯著時(shí)期和區(qū)段分布特點(diǎn)的蛋白質(zhì)BmAGXT2、BmHYI、Bmhibadh的編碼基因Bmagxt2、Bmhyi、Bmhibadh進(jìn)行了克隆和分析；同時(shí)采用RT-PCR、原核表達(dá)、Western blotting等技術(shù)對(duì)Bmagxt2、Bmhyi的功能進(jìn)行了研究；

4、測(cè)定了BmAGXT2在馬氏管五齡期到蛹期、五齡期各區(qū)段中的酶活力。
　　 1.家蠶馬氏管五齡第5天LC MS/MS及2D-MALDI-TOF MS分析
　　 LC MS/MS液向-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的技術(shù)現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)中。在本研究中采用了LTQ VELOS質(zhì)譜儀，成功的鑒定了家蠶五齡第5天馬氏管表達(dá)蛋白質(zhì)。我們采用了構(gòu)建正反庫(kù)的方式和TPP軟件的篩選功能對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行了質(zhì)量控制，增加了蛋白的鑒定

5、可信度。最終，我們一共鑒定到了1367個(gè)非重復(fù)蛋白質(zhì)，其中80.54％的鑒定蛋白質(zhì)理論分子量分布在10-100kD之間，98.90％的鑒定蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)分布在4-12之間；而家蠶9倍基因組預(yù)測(cè)的所有蛋白質(zhì)中有82.48％的理論分子量分布在10-100 kD之間，97.82％的理論等電點(diǎn)分布在4-12之間。其中有41個(gè)蛋白質(zhì)同時(shí)在雙向電泳中檢測(cè)到，且這些蛋白質(zhì)在雙向電泳圖譜中發(fā)現(xiàn)的表達(dá)量和APEX分析結(jié)果相似。我們對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行了家

6、族分類、GO分類、pathway分類后發(fā)現(xiàn)：家蠶的馬氏管不僅完成了調(diào)節(jié)體內(nèi)水分和鹽分的作用，除了功能相似之外，其與哺乳動(dòng)物的腎臟在多個(gè)代謝通路上有著相似之處，并且二者可能還有更多的關(guān)聯(lián)。作為專一食桑葉的昆蟲(chóng)，家蠶選擇了以馬氏管作為場(chǎng)所來(lái)完成對(duì)桑葉揮發(fā)油成分的代謝。在馬氏管中的GSTs、P450s、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenases)等蛋白質(zhì)家族來(lái)處理外源性和內(nèi)源性的有害物質(zhì)，達(dá)到機(jī)體免受其傷害的目的。
　　

7、 2.五齡第5天馬氏管分段雙向電泳與質(zhì)譜分析及代謝產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的鑒定
　　 通過(guò)顏色觀察和查閱文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)家蠶馬氏管至少可以分為3個(gè)區(qū)段，對(duì)這三個(gè)區(qū)段分別進(jìn)行DAPI染色30 min后的結(jié)果顯示，第Ⅰ區(qū)段染色主要集中在馬氏管管腔內(nèi)側(cè)；第Ⅱ區(qū)段染色質(zhì)呈網(wǎng)狀分布；第Ⅲ區(qū)段染色質(zhì)呈顆粒狀分布。說(shuō)明這3個(gè)區(qū)段有較大的區(qū)別。為了了解馬氏管各區(qū)段的蛋白質(zhì)分布情況，分別對(duì)這3個(gè)區(qū)段進(jìn)行了雙向電泳，我們發(fā)現(xiàn)BmAGXT2、BmHYI、Bmhi

8、badh、BmActin3在各區(qū)段中有較大差異，其中BmAGXT2主要分布于第1區(qū)段(遠(yuǎn)離直腸端)，第2區(qū)段、第2區(qū)段中分布較少；BmHYI、Bmhibadh在第1區(qū)段的分布量也大于其他區(qū)段；而B(niǎo)mActin3在第3區(qū)段中的量最大。
　　 在研究中，我們對(duì)化蛾第2天馬氏管內(nèi)容物中的蛋白質(zhì)情況進(jìn)行了雙向電泳-質(zhì)譜分析，成功鑒定到其中3個(gè)蛋白點(diǎn)，均為典型的抗菌肽蛋白質(zhì)hemolin，推測(cè)可能蛹期及蛾期免疫有關(guān)。
　　 3.家

9、蠶幼蟲(chóng)期和蛹期馬氏管差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)對(duì)家蠶五齡第5天及化蛹第1天的馬氏管組織進(jìn)行比較，并采用基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對(duì)表達(dá)量差異較大的蛋白點(diǎn)進(jìn)行肽指紋圖譜鑒定，應(yīng)用GPMAW8.00軟件對(duì)NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中所有來(lái)自于P50/Dazao的蛋白質(zhì)與家蠶9倍基因組預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)庫(kù)共同構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)試驗(yàn)采集到的肽指紋圖譜進(jìn)行分析。共檢測(cè)到360～430個(gè)蛋白點(diǎn)，主要分布

10、在分子質(zhì)量15～80 kD、等電點(diǎn)4.0～9.5的范圍內(nèi)。兩個(gè)時(shí)期共有17個(gè)表達(dá)量有顯著差異的蛋白質(zhì)被成功鑒定，其中包括與能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)、熱激蛋白、V型H+ATP合酶、30K蛋白以及與腎臟功能密切相關(guān)的丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶2(BmAGXT2)，3-羥基異丁酸脫氫酶(Bmhibadh)等。研究結(jié)果可以為家蠶馬氏管怎樣實(shí)現(xiàn)從幼蟲(chóng)期代謝桑葉消化產(chǎn)物功能為主到蛹期代謝消耗脂肪體及儲(chǔ)藏蛋白的產(chǎn)物功能為主的巨大轉(zhuǎn)變提供蛋白質(zhì)水平上的依據(jù)。<

11、br>　　 4.Bmagxt2、Bmhyi、Bmhibadh基因的克隆、序列分析及mRNA表達(dá)
　　 根據(jù)基因組中Bmagxt2、Bmhyi、Bmhibadh的序列，設(shè)計(jì)引物，克隆基因，經(jīng)過(guò)酶切和測(cè)序驗(yàn)證得到三個(gè)基因的陽(yáng)性克隆。從基因結(jié)構(gòu)上分析，Bmagxt2基因CDS長(zhǎng)為2080 bp，編碼的蛋白含260個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白的分子量大小為50.38 kD，等電點(diǎn)為7.70，具有9個(gè)外顯子，8個(gè)內(nèi)含子，在基因組上僅有一個(gè)拷貝

12、，位于11號(hào)染色體nscaf3031上。SignalP預(yù)測(cè)沒(méi)有信號(hào)肽，為分泌型蛋白；TMHMM預(yù)測(cè)沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)。Bmhyi基因CDS長(zhǎng)為783 bp，編碼的蛋白含260個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白的分子量大小為29.17 kD，等電點(diǎn)為6.10，含有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子，在基因組上僅有一個(gè)拷貝，位于nscaf2360上，染色體定位情況未知。SignalP預(yù)測(cè)沒(méi)有信號(hào)肽，為分泌型蛋白；TMHMM預(yù)測(cè)沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)。Bmhibadh基因CDS長(zhǎng)為96

13、9 bp，編碼的蛋白含322個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白的分子量大小為34.01 kD，等電點(diǎn)為9.24，含有6個(gè)外顯子，5個(gè)內(nèi)含子，在基因組上僅有一個(gè)拷貝，位于17號(hào)染色體nscaf2865上。SignalP預(yù)測(cè)信號(hào)肽為第1-21個(gè)氨基酸殘基(MAARTILSTQCLYTAARRAYS)；TMHMM預(yù)測(cè)前60個(gè)氨基酸殘基為跨膜結(jié)構(gòu)。
　　 為了了解三個(gè)基因在家蠶各時(shí)期、組織的表達(dá)特征，我們利用家蠶ESTs、基因芯片數(shù)據(jù)以及RT-PC

14、R方法進(jìn)行了分析。ESTs分析結(jié)果顯示Bmagxt2、Bmhyi、Bmhibadh均具有EST證據(jù)。在家蠶馬氏管、中腸中Bmagxt2有EST證據(jù)。在家蠶卵巢、血細(xì)胞、馬氏管、中腸、脂肪體、絲腺中Bmhyi有EST證據(jù)，在家蠶中腸、翅原基、馬氏管、胚胎、血細(xì)胞、脂肪體、絲腺中Bmhibadh有EST證據(jù)。
　　 對(duì)家蠶全基因組芯片的組織表達(dá)數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示：Bmagxt2基因在家蠶五齡第3天的各組織中的mRNA的量都很低，除卵

15、巢、精巢、脂肪體這三個(gè)組織有極少量外，其他組織中幾乎沒(méi)有mRNA的存在。Bmhyi基因在絲腺、卵巢、精巢、馬氏管、體壁、頭、血液、脂肪體、中腸中均有不同程度的表達(dá)，其中絲腺中表達(dá)量較低，而馬氏管、血液、脂肪體、中腸中表達(dá)量較高，尤其馬氏管中表達(dá)量很高。Bmhibadh基因在在家蠶五齡第3天的各組織中幾乎沒(méi)有表達(dá)。對(duì)早期胚胎和熟蠶期到蛾期的芯片數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示：Bmhibadh發(fā)育時(shí)期、早期胚胎無(wú)數(shù)據(jù)。Bmagxt2基因在胚胎早期和上蔟

16、第8-9天有很微弱量的表達(dá)，其他時(shí)期幾乎不表達(dá)；Bmhyi基因在整個(gè)胚胎期、熟蠶期至蛾期都沒(méi)有表達(dá)。
　　 為了進(jìn)一步補(bǔ)充和驗(yàn)證表達(dá)譜，我們進(jìn)行了半定量RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示：Bmagxt2基因在家蠶五齡第3天幼蟲(chóng)生殖腺、體壁、脂肪體表達(dá)量較高，在頭和馬氏管中有微弱表達(dá)；而從1齡眠期到五齡第7天的期間內(nèi)均有表達(dá)。Bmhyi基因在家蠶五齡第3天幼蟲(chóng)脂肪體、表皮、血細(xì)胞中有微弱表達(dá)，馬氏管中表達(dá)量較高；而從蟻蠶期到上蔟后第10天

17、期間都有表達(dá)，整體表現(xiàn)為幼蟲(chóng)期表達(dá)量大于蛹期，上蔟后36-72 h表達(dá)量小于上蔟后96 h到上蔟后第10天。Bmhibadh基因在家蠶五齡第3天幼蟲(chóng)各組織中均有表達(dá)，馬氏管和絲腺中的表達(dá)量略高于其他組織；而在幼蟲(chóng)期各時(shí)間點(diǎn)均有一定量表達(dá)，總體趨勢(shì)表現(xiàn)為眠期表達(dá)量小于起蠶期；上蔟后該基因幾乎無(wú)表達(dá)，一直到上蔟后第8天才有極微弱的表達(dá)量，并一直保持到蛾期。
　　 5.Bmagxt2、Bmhyi的原核表達(dá)、抗體制備及western b

18、lotting檢測(cè)
　　 為了對(duì)基因功能進(jìn)行進(jìn)一步研究，我們將Bmagxt2和Bmhyi分別與p29和p28表達(dá)載體相連接，相應(yīng)命名為Bmagxt2/p29和Bmhyi/p28，并轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達(dá)菌株中。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后分別得到分子量約為51 kD和30 kD的重組包涵體蛋白質(zhì)，而目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量約為50.38 kD和29.17 kD，加上6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，大小約為51 kD和30 kD，與預(yù)測(cè)分子量大小基本一致。<

19、br>　　 通過(guò)Ni+親和柱和電洗脫純化，得到了較高濃度的原核表達(dá)包涵體蛋白質(zhì)BmAGXT2、BmHYI。將這兩個(gè)蛋白質(zhì)免疫成年健康雄兔后，取得血清，純化得到多克隆抗體。利用抗體檢測(cè)Bmagxt2和Bmhyi在家蠶五齡第5天各組織的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，BmAGXT2蛋白質(zhì)在馬氏管和血液中有表達(dá)，尤其在馬氏管中表達(dá)量很高，這與我們?cè)陔p向電泳試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象一致。Bmhyi蛋白質(zhì)只在馬氏管中有表達(dá)。而進(jìn)一步的雙向western blott

20、ing結(jié)果顯示，與五齡第5天相比較，化蛹第1天馬氏管中的BmAGXT2和BmHYI都有很大程度的減少，這一結(jié)果之前的雙向電泳中觀察的結(jié)果一致。
　　 6.丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶2(BmAGXT2)活性檢測(cè)
　　 為了研究BmAGXT2蛋白在馬氏管中的活性情況是否與其表達(dá)量具有相關(guān)性，我們參照其在人和小鼠同源蛋白的酶活性測(cè)定方法，測(cè)定了BmAGXT2從五齡第3天到化蛹第7天以及其在五齡第5天馬氏管各區(qū)段中的酶活性，結(jié)果顯