C5a反義肽對膿毒癥心肌損傷的影響及潛在的機制研究.pdf

1、嚴重膿毒癥(severe sepsis)和膿毒癥休克是危重病病人死亡的首要原因。盡管采取了改善外科療法、抗生素治療和免疫調(diào)節(jié)等手段,膿毒癥仍然是導致重癥監(jiān)護病人最常見死因。膿毒癥是機體對感染發(fā)生免疫和炎癥應答的表現(xiàn)。嚴重膿毒癥定義為膿毒癥伴有臟器功能衰竭,而膿毒癥休克定義為膿毒癥給予充分液體復蘇后仍伴有頑固性低血壓；其中,膿毒癥的心肌損害參與了膿毒癥休克的發(fā)生與發(fā)展。晚近文獻報道,嚴重膿毒癥的年發(fā)病率為每100000人口中132人,死亡

2、率達50％。美國的臨床觀察發(fā)現(xiàn),膿毒癥病人普遍存在心肌收縮力下降；75％的膿毒癥患者存在心血管功能衰竭,表現(xiàn)為嚴重、持續(xù)、甚至有時是頑固性低血壓。在過去10年中,臨床觀察及實驗研究證實膿毒癥休克病人的心血管功能衰竭與膿毒癥的心肌損害有關。細菌或內(nèi)毒素(LPS)啟動了一系列炎癥反應,導致心肌收縮力降低、左心室擴大、射血分數(shù)下降、對容量負荷收縮反應差、收縮峰值壓力/收縮末期容積比值下降等。這種膿毒癥和其他全身炎癥過程所引起的心肌抑制和細胞損

3、傷,極大的增加氧耗,抑制微循環(huán),減少心肌氧輸送,最終導致心肌損傷和肌鈣蛋白釋放入血循環(huán)。心肌抑制與損傷的原因目前尚不明確,因此,探討其發(fā)生機制,尋求防治膿毒癥心功能障礙的發(fā)生和發(fā)展的有效手段,對膿毒癥的救治有重要的臨床意義。
　　 目前認為細胞因子的產(chǎn)生和炎癥介質(zhì)的釋放可能在膿毒癥心肌損傷起一定作用,包括腫瘤壞死因子(TNF)、IL-1、IL-6等:白細胞衍生的超氧化物及其分子及Caspase的激活,均可能參與心肌損傷的發(fā)病。實

4、驗研究顯示,膿毒癥時微血管灌注和心肌氧攝取受損具有不均一性,其潛在的細胞機制包括中性粒細胞激活與內(nèi)皮的粘附、以及其釋放活性自由基和氧化產(chǎn)物等對血管內(nèi)皮和心肌細胞損傷,導致其功能障礙。同時,內(nèi)皮細胞活化產(chǎn)生的NO、內(nèi)皮素以及前列腺素等增多,抑制心肌小梁等長收縮；并促進中性粒細胞跨內(nèi)皮遷移并活化循環(huán)中性粒細胞進入心肌間質(zhì)；而激活的中性粒細胞所致血管內(nèi)皮和心肌細胞炎癥損傷,增加血管滲漏。因此,中性粒細胞的粘附遷移級聯(lián)過程在膿毒癥心肌抑制的發(fā)生

5、發(fā)展中起著重要作用。MPO是中性粒細胞的特異性酶,能催化產(chǎn)生多種活性氧化物質(zhì),導致氧化應激和氧化性組織損傷,其激活程度與中性粒細胞的浸潤程度密切相關,其活性的測定可以反映中性粒細胞浸潤情況。
　　 P-選擇素是一種高糖基化的單鏈跨膜糖蛋白,是細胞粘附分子選擇素家族成員,分子量140KD,主要存在于靜息血小板的α顆粒及內(nèi)皮細胞的Weibel-Palade小體中,通過介導細胞起始粘附、啟動參與了包括白細胞的粘附遷移級聯(lián)過程,在炎癥、

6、血栓形成中起著重要作用；同時,P-選擇素是影響中性粒細胞與內(nèi)皮細胞間粘附的重要因子之一。靜止狀態(tài)下,血小板或內(nèi)皮細胞表面不表達P-選擇素,在各種刺激因素刺激下,血小板的α顆粒和內(nèi)皮細胞的Weibel-palade小體膜與細胞膜迅速融合,導致P-選擇素于數(shù)分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞表面,通過與中性粒細胞表面的P-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)相互作用,促進血小板或內(nèi)皮細胞與中性粒細胞的粘附,介導中性粒細胞在內(nèi)皮上滾動、遷移、聚集和活化。在膿毒

7、癥中,P-選擇素的主要作用包括介導活化的血小板和單核細胞及中性粒細胞的連接,以及內(nèi)皮細胞與中性粒細胞的快速粘附、啟動炎癥反應:與L-選擇素、E-選擇素共同介導白細胞浸潤,引起血管內(nèi)皮細胞功能紊亂和組織損傷。
　　 作為多種補體激活途徑的共同產(chǎn)物C5a與膿毒癥免疫麻痹、多器官功能衰竭及淋巴細胞凋亡密切相關,在膿毒癥的病理生理過程中,通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)、參與凝血、促進PMN聚集、抑制PMN先天免疫、誘導淋巴細胞凋亡等方面起重要作用；C

8、5a作為心肌抑制因子之一對心肌具有直接抑制作用。拮抗C5a已被膿毒癥動物實驗所證實；本課題組前期自主篩選合成了一種新型C5a拮抗多肽(C5a反義肽),相關實驗證明了其能拮抗C5a的生物學活性,并可改善小鼠膿毒癥模型的炎癥反應。國外研究發(fā)現(xiàn)應用抗C5a抗體可逆轉(zhuǎn)膿毒癥導致的左心室壓力及心肌收縮力的減低,但其具體機制目前尚不明確。在相關的研究顯示,內(nèi)皮細胞P-選擇素的表達隨著C5a濃度的增加而增加,中性粒細胞粘附率也表現(xiàn)類似的趨勢；而阻斷C

9、5a可使肺組織中性粒細胞浸潤程度顯著減輕。但P-選擇素表達對膿毒癥中性粒細胞在心肌組織中的扣押與損傷有待進一步研究；同時,新合成的C5a反義肽能否在體內(nèi)拮抗C5a引起內(nèi)皮細胞的P-選擇素過表達及中性粒細胞浸潤,從而改善心肌損傷也有待驗證。
　　 目的
　　 探討膿毒癥時心肌組織中性粒細胞浸潤與心肌損傷的關系；研究心肌組織P-選擇素表達情況與中性粒細胞浸潤/扣壓及心肌損傷的關系；驗證靜脈注射C5a反義肽對心肌損傷的保護作用

10、及可能的機制,為膿毒癥早期心肌損傷提供新的治療靶點。
　　 方法
　　 1)采用盲腸結(jié)扎穿孔法建立小鼠膿毒癥模型,分正常組、假手術(shù)組、膿毒癥組、反義肽干預組,在不同時間點(2h、4h、8h、12h)用ELISA方法,檢測血清肌鈣蛋白Ⅰ濃度,采用MPO試劑盒檢測心肌組織MPO活性,比較各時間點各組血清肌鈣蛋白Ⅰ濃度和心肌組織MPO活性,了解膿毒癥心肌損傷與心肌組織中性粒細胞聚集的關系,觀察靜脈注射C5a反義肽對心肌損傷及心

11、肌組織中性粒細胞聚集的影響；
　　 2)采用實時熒光定量PCR和免疫印跡方法檢測心肌組織P-選擇素基因和蛋白水平的變化情況,了解膿毒癥時心肌組織P-選擇素表達水平及與時間的關系,研究其與心肌損傷和心肌組織中性粒細胞聚集的關系,比較各組P-選擇素表達水平,探討靜脈注射C5a反義肽對P-選擇素表達水平的影響。
　　 結(jié)果
　　 1)C5a反義肽對心肌損傷及心肌組織中性粒細胞聚集的影響
　　 正常小鼠心肌組織M

12、PO含量為0.611±0.061U/g。假手術(shù)組各時間點心肌組織MPO活性與正常組類似(P>0.05)。造模組2h、4h、8h、12h測得的心肌組織MPO含量分別為1.260±0.068 U/g、1.520±0.105 U/g、1.696±0.041 U/g、1.758±0.136 U/g；反義肽干預組各時間點測得的心肌組織MPO含量分別為1.067±0.095 U/g、1.327±0.093 U/g、1.331±0.053 U/g、1

13、.421±0.185 U/g。與假手術(shù)組相比,造模組和反義肽干預組各時間點心肌組織MPO含量有顯著升高(P<0.05)；和造模組相比,反義肽干預組心肌組織MPO含量有顯著下降(P<0.05)。假手術(shù)組各時間點cTnI的濃度與正常組類似(P>0.05)。造模組2h、4h、8h、12h測得的cTnI濃度分別為0.017±0.009 ng/ml、0.106±0.008 ng/ml、0.528±0.066 ng/ml、2.959±0.170 n

14、g/ml。反義肽干預組各時間點cTnI濃度為0.017±0.005 ng/ml、0.062±0.006 ng/ml、O.124±0.008 ng/ml、1.469±0.191 ng/ml。與假手術(shù)組相比,在造模后2小時造模組、反義肽干預組cTnI濃度均無顯著升高(P>0.05)；造模4小時后造模組和反義肽干預組cTnI濃度較假手術(shù)組均有顯著升高(P<0.05),且隨著時間的延長,cTnI濃度呈上升趨勢；和造模組相比,反義肽干預組cTnI

15、濃度有顯著下降(P<0.05)。
　　 2)C5a反義肽治療膿毒癥小鼠心肌損傷與P-選擇素的相關性
　　 正常組和假手術(shù)組各時間點P-選擇素mRNA表達量無顯著性差異；而造模組和反義肽干預組P-選擇素mRNA表達量隨著時間的增加而顯著增加。在2、4、8、12各時間點,假手術(shù)組P-選擇素mRNA表達量分別為:0.726±0.307、0.841±0.443、1.558±0.658、1.162±0.172,和正常組比較無顯著性

16、差異(P>0.05),造模組各時間點P-選擇素mRNA表達量分別為:5.311±0.990、9.799±0.719、104.336±13.511、192.267±16.611,反義肽干預組P-選擇素mRNA表達量分別為:2.76±0.199、4.889±0.772、52.877±8.900、87.878±3.475,與正常組和假手術(shù)組比均有顯著性增高(P>0.05)；與造模組相比,在4、8、12h時間點,反義肽干預組P-選擇素mRNA表

17、達量有顯著下降(P<0.05)。
　　 正常組和假手術(shù)組各時間點P-選擇素蛋白表達量無顯著性差異(P>0.05)；造模組2h、4h、8h、12h四個時間點各組的P-選擇素蛋白相對定量分別為0.399±0.019、0.643±0.023、0.681±0.024和0.69±0.021；與正常及假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；反義肽干預組2h、4h、8h、12h四個時間點P-選擇素蛋白相對定量分別為0.29±0.031、

18、0.43±0.010、0.456±0.013和0.480±0.017；顯著低于造模組(P<0.05),但與對照組相比,仍顯著高于對照組(P<0.05)。
　　 3)心肌組織P-選擇素mRNA表達與心肌組織MPO活性,顯著正相關,(r=0.728,P=0.000)；心肌組織P-選擇素蛋白表達與心肌組織MPO活性呈顯著正相關,(r=0.961,P=0.000)
　　 結(jié)論
　　 1)膿毒癥早期即己出現(xiàn)心肌損傷,且心肌