人工設(shè)計PPR蛋白的組裝及其對靶標(biāo)RNA的特異識別研究.pdf

1、PPR蛋白是一類能特異識別并結(jié)合RNA的蛋白，在真核生物RNA的多種代謝途徑中起著非常重要的作用。它廣泛分布在高等植物中，主要定位于葉綠體和線粒體。通常情況下，PPR蛋白含有2-30個串聯(lián)重復(fù)單元，每個重復(fù)單元含有35個氨基酸，其識別RNA的方式是模塊化的，即一個重復(fù)單元識別一個RNA堿基，這種模塊化的識別特點賦予PPR蛋白可被人工設(shè)計并用于RNA操作的潛力。已有的生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究表明，每個重復(fù)單元的第5位、35位氨基酸在

2、RNA特異識別過程中起著至關(guān)重要的作用，被稱為氨基酸組合識別密碼(code)。理論上，這種氨基酸組合識別密碼理論上有400種，目前，只有少部分code通過生化和結(jié)構(gòu)的研究方法被解析，而大多數(shù)的code與RNA堿基之間的對應(yīng)關(guān)系及具體的識別機制還不是很清楚，這對于PPR蛋白功能研究及其進(jìn)一步應(yīng)用十分不利，因此亟需破解PPR蛋白的不同氨基酸組合與所識別的RNA堿基之間的對應(yīng)關(guān)系。這需要大量不同code的PPR蛋白，合成這樣的具有串聯(lián)重復(fù)序列

3、的PPR基因耗時長且成本高昂。
　　本研究致力于開發(fā)一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的組裝方法用于構(gòu)建具有不同code的人工設(shè)計PPR(designer PPR，dPPR)序列。本研究基于TypeⅡs限制性內(nèi)切酶的序列識別特點和Golden Gate cloning的基本原理進(jìn)行設(shè)計改造，分三步構(gòu)建全長dPPR序列。以構(gòu)建10 repeats(10R)為例，第一步通過“限制性酶切-連接”一步法構(gòu)建3 repeats(3R)初級元件，第二步將3

4、R元件通過“限制性酶切-連接”一步法構(gòu)建9 repeats(9R)二級元件，第三步將9R元件克隆構(gòu)建在改造的表達(dá)接收載體上，表達(dá)接收載體上含有1個“repeat”，最終拼接成完整的具有10個重復(fù)單元的dPPR序列。
　　本研究成功利用組裝的序列表達(dá)出目標(biāo)蛋白，并利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法、電泳遷移率實驗的方法驗證了數(shù)種密碼與RNA堿基之間的對應(yīng)關(guān)系。
　　綜上所述，本研究首次開發(fā)了一套快速高效的方法用于組裝能識別特定堿