脆性X相關(guān)蛋白1的靶標(biāo)鑒定及其對IQCE翻譯的影響.pdf

1、脆性X綜合征(Fragile X syndrome, FXS)是世界范圍內(nèi)最常見的遺傳性智力低下疾病之一。99％的患者是由于FMRP（Fragile X mental retardation protein，脆性 X智力低下蛋白）表達(dá)下降或功能缺失所導(dǎo)致?？茖W(xué)家在常染色體上發(fā)現(xiàn)一個與FMR1(脆性X智力低下基因1)非常相似的基因，被命名為脆性X相關(guān)基因1(Fragile X-related Gene1, FXR1），編碼脆性X相關(guān)蛋白1

2、（FXR1P）。FXR1P是脆性X RNA結(jié)合蛋白（RNA Binding proteins,RBPs）家族的成員，研究提示它已經(jīng)牽涉到RNA調(diào)控的多個方面，包括mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)，穩(wěn)定性和翻譯。發(fā)現(xiàn)并鑒定FXR1P新的mRNA靶標(biāo)，對于研究FXR1P的功能以及脆性X綜合征的發(fā)病機(jī)理有著非常重要的意義。
　　目的：利用報告基因系統(tǒng)鑒定FXR1P的新的mRNA靶標(biāo)。通過報告基因系統(tǒng)初步研究FXR1P與其mRNA靶標(biāo)的相互作用及其對靶標(biāo)翻

3、譯的影響。
　　方法：1）生物信息學(xué)分析FMRP蛋白家族PAR-CLIP和RIP-chip實驗數(shù)據(jù)，得到FMRP蛋白家族與其靶標(biāo)相互作用位點(diǎn)的分布，并對FXR1P的作用位點(diǎn)進(jìn)行分析。2）利用基因工程技術(shù)構(gòu)建pSEAP-B2M ORF，pSEAP-TNF3’UTR， pSEAP-FXR13’UTR，pSEAP-IQCE3’UTR重組報告基因載體，并進(jìn)行酶切鑒定和測序分析。3）通過Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體pc

4、DNA3.1(-)/FXR1至Hela細(xì)胞和大鼠心肌細(xì)胞，Western blot檢測過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效率。4）按照一定的分組要求，將過表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/FXR1、對照載體pSV-β-Gal和報告基因載體 pSEAP-插入片段，共轉(zhuǎn)染至 Hela細(xì)胞和大鼠心肌細(xì)胞中。用β-半乳糖甘酶檢測試劑盒檢測β-半乳糖甘酶活性，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測報告基因分泌型堿性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase S

5、EAP)的活性。
　　結(jié)果：1）生物信息學(xué)分析顯示FMRP蛋白家族（包括FXR1P）的靶RNAs主要定位于基因組的外顯子區(qū)域，與mRNA的結(jié)合位點(diǎn)主要分布在 CDS區(qū)和3’UTR區(qū)域。2）構(gòu)建了pSEAP-B2M ORF，pSEAP-TNF3’UTR，pSEAP-FXR1 3’UTR，pSEAP-IQCE3’UTR重組報告基因載體，經(jīng)酶切鑒定和測序分析可知載體構(gòu)建成功。3） Western blot結(jié)果顯示pcDNA3.

6、1(-)/FXR1重組載體成功轉(zhuǎn)染至hela細(xì)胞和大鼠心肌細(xì)胞中并且過表達(dá)FXR1P。4）在hela細(xì)胞中FXR1P的過表達(dá)對包含假定靶標(biāo)IQCE3’UTR及FXR13’UTR的重組報告基因的表達(dá)的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義。但是在大鼠心肌細(xì)胞中，F(xiàn)XR1P的過表達(dá)能明顯的降低IQCE3’UTR重組報告基因的表達(dá)，對含有FXR13’UTR的重組報告基因的表達(dá)的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.生物信息學(xué)分析顯示FMRP蛋白家