紫花前胡苷對(duì)尿毒癥血清誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討紫花前胡苷(Nodakenin)對(duì)尿毒癥患者血清誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transitiontrans-differentiation，EMT)的影響及可能的機(jī)制，為防治腎間質(zhì)纖維化提供新的可能的有效途徑。
　　方法：無(wú)菌條件下收集西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科以及體檢中心2016年6月至2016年10月之間的10名尿毒癥患者和10名正常人的血清，分別取等

2、量混合在一起備用。將體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞分為正常組（10％正常人血清）、模型組（10％尿毒癥血清）、紫花前胡苷對(duì)照組（10％正常人血清+紫花前胡苷80ng/ml）、紫花前胡苷低劑量干預(yù)組（10％尿毒癥血清+紫花前胡苷20ng/ml）、紫花前胡苷中劑量干預(yù)組（10％尿毒癥血清+紫花前胡苷40ng/ml）、紫花前胡苷高劑量干預(yù)組（10％尿毒癥血清+紫花前胡苷80ng/ml）。倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)，應(yīng)用CCK-8法測(cè)定各組細(xì)胞的增

3、殖活性，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)測(cè)定細(xì)胞上清液中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)蛋白的含量，細(xì)胞表達(dá)α-SMA、E-鈣黏素(E-cadherin)、smad3、P-smad3、上皮緊密連接蛋白（Zonula occludens1，ZO-1）、纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、白細(xì)胞介素-6(I

4、ntedeukin-6，IL-6)、Toll樣受體4(Toll-Like Recepter4,TLR4)、IKKβ、P-IKKβ、NF-KB P65、P-NF-KB P65蛋白的表達(dá)情況由蛋白印記法(Western blot，WB)檢測(cè)。免疫熒光(Immunofluorescence，IF)檢測(cè)P-smad3、ZO-1的表達(dá)情況，免疫組化技術(shù)（Immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)細(xì)胞白細(xì)胞介素-6(Intedeukin

5、-6，IL-6)蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.尿毒癥患者血清對(duì)HK-2細(xì)胞的影響：與正常組相比，20％和40％尿毒癥血清組細(xì)胞的增殖活性明顯下降(P＜0.05)，5％和10％尿毒癥血清組的細(xì)胞上清液中的TGF-β含量明顯增高(P＜0.01），故將10％作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的血清刺激濃度。10％尿毒癥血清刺激48小時(shí)的時(shí)候細(xì)胞開始變細(xì)、變長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形，α-SMA蛋白表達(dá)增強(qiáng)，E-cadherin以及ZO-1蛋白的表達(dá)減弱，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差

6、異(P＜0.01）。2.在10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml紫花前胡苷濃度下時(shí)，HK-2細(xì)胞的增殖活性無(wú)明顯差異(P＞0.05)。與正常組相比，尿毒癥血清刺激48小時(shí)后，人腎小管上皮細(xì)胞胞體明顯變細(xì)、變長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形，經(jīng)紫花前胡苷干預(yù)后，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形逐漸轉(zhuǎn)變回正常的多邊形或者三角形。相較于正常組，尿毒癥血清刺激HK-2細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞TGF-β、P-smad3、α-SMA、Fibronec

7、tin蛋白的表達(dá)明顯增加，中劑量及高劑量紫花前胡苷作用能使其表達(dá)有所減少，且具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，各組smad3蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。相較于正常組，模型組的E-cadherin及ZO-1表達(dá)有所減弱，中劑量及高劑量紫花前胡苷干預(yù)能使其有增加趨勢(shì)。3.相較于正常組，尿毒癥血清刺激24小時(shí)后，細(xì)胞TLR4、IL-6、P-NF-KB P65、p-IKKβ蛋白的表達(dá)明顯增加，中劑量及高劑量紫花前胡苷干預(yù)能減少其表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)