多期聯(lián)合瘧疾疫苗抗原結(jié)構(gòu)與免疫保護(hù)作用的研究.pdf

1、瘧疾仍是嚴(yán)重危害人類健康的寄生蟲病。由于瘧原蟲抗藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散，以及蚊媒對殺蟲劑產(chǎn)生抗性并逐漸蔓延，使得傳統(tǒng)的瘧防措施面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。研發(fā)安全、有效的瘧疾疫苗是當(dāng)今最有希望的瘧疾防治方法之一。瘧疾相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查以及實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果均表明，研制有效的瘧疾疫苗是可行的。長期在瘧疾流行區(qū)生活的居民體內(nèi)可以產(chǎn)生針對瘧疾的免疫力，在高瘧區(qū)，10歲以上的人群極少發(fā)生重癥瘧疾。
　　 從長期生活在西非瘧疾流行區(qū)的成年人體內(nèi)提取的IgG，被動免

2、疫治療重癥瘧疾患兒，能使其外周血原蟲密度降低99％。此外，給志愿者反復(fù)接種經(jīng)輻照減毒的瘧原蟲子孢子，可使人體產(chǎn)生完全的保護(hù)性免疫力。這些研究結(jié)果為研制有效瘧疾疫苗提供了重要依據(jù)。瘧疾疫苗研究已進(jìn)行了近三十年，目前已鑒定了一批包含瘧原蟲生活史各期的疫苗候選抗原。這些抗原在動物試驗(yàn)中都能產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，并且在體外或動物模型中顯示出不同程度的保護(hù)效力，其中一些疫苗候選抗原已進(jìn)入臨床研究，并顯示出較好的免疫保護(hù)效果，如以惡性瘧原蟲環(huán)子

3、孢子蛋白為基礎(chǔ)的RTS,S瘧疾疫苗已進(jìn)入III 期臨床試驗(yàn)，其疫苗制劑RTS,S/ AS01E在非洲兒童中進(jìn)行的臨床試驗(yàn)顯示出一定的保護(hù)力（39.2％～45.8％），能持續(xù)15個月以上。然而，瘧疾疫苗研發(fā)仍面臨一些的困難，包括：（1）瘧疾免疫保護(hù)機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)有疫苗候選抗原免疫原性較弱，單獨(dú)使用不能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)效力；（2）缺乏有效的動物模型以評價疫苗的體內(nèi)免疫保護(hù)效力；（3）瘧原蟲抗原變異和存在多種免疫逃避的機(jī)制；（4）缺乏強(qiáng)效

4、人用疫苗佐劑等。
　　 研制由瘧原蟲生活史多個時期抗原組成的多期聯(lián)合疫苗是當(dāng)今瘧疾疫苗的發(fā)展趨勢。由于瘧原蟲生活史復(fù)雜，瘧原蟲抗原有明顯期特異性和株間變異，因此普遍認(rèn)為，一個有效的疫苗需要由針對多個生長環(huán)節(jié)的抗原組成，這樣可增強(qiáng)疫苗的有效性和克服瘧原蟲變異性等問題。特別是將紅內(nèi)期抗原與紅外期抗原聯(lián)合，這種聯(lián)合疫苗對紅內(nèi)期和紅外期原蟲均能產(chǎn)生殺滅作用。此外，選用合適的人用佐劑也是瘧疾疫苗研發(fā)的重要內(nèi)容。研究已表明，瘧疾保護(hù)性免疫需

5、要相當(dāng)高的免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此需要尋找或研制一種能在人體應(yīng)用的強(qiáng)效佐劑，并與瘧疾疫苗抗原聯(lián)合應(yīng)用。
　　 本實(shí)驗(yàn)室在瘧疾疫苗研發(fā)方面已開展了系列工作。PfCP-2.9抗原是由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和研制的一種紅內(nèi)期瘧疾疫苗候選抗原，該抗原是由惡性瘧原蟲裂殖子表面抗原1（MSP1）和頂端膜抗原1（AMA-1）的C-末端片段融合而成。在前期的實(shí)驗(yàn)室和臨床研究中，該抗原顯示出良好的發(fā)展前景：（1）在畢氏酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)產(chǎn)量高，且可溶性和穩(wěn)定

6、性高；（2）在小鼠、家兔、猴動物模型中均顯示較強(qiáng)的免疫原性，在家兔中能誘導(dǎo)產(chǎn)生較單個組分高10倍以上的抗體；（3）家兔和恒河猴的免疫血清在體外有良好的抑制瘧原蟲生長的效力；（4）兩次臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示該抗原在人體具有良好的安全性和免疫原性。然而，PfCP-2.9融合抗原的構(gòu)象是個尚未解決重要問題，特別是這兩個二硫鍵十分豐富的蛋白融合為一個分子后，是否能形成各自的正確構(gòu)象以及兩個抗原是否存在相互作用等問題，均受到普遍關(guān)注。
　　 本

7、研究采用多維核磁共振NMR 技術(shù)對PfCP-2.9蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。我們制備了15N 單標(biāo)記和13C、15N 雙標(biāo)記PfCP-2.9 重組蛋白以及15N 單標(biāo)記PfMSP119 重組蛋白，通過將融合蛋白中指認(rèn)的氨基酸化學(xué)位移與已知單個組分氨基酸化學(xué)位移的對比，分析其結(jié)構(gòu)變化。此外，我們開展了以PfCP-2.9和PfCSP-2抗原為基礎(chǔ)的多期聯(lián)合疫苗的免疫學(xué)和臨床前研究。本研究取得主要結(jié)果如下：
　　 （一）PfCP-2.9疫苗候

8、選抗原的結(jié)構(gòu)解析
　　 為研究PfCP-2.9抗原的三維結(jié)構(gòu)，我們在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了15N單標(biāo)記、15N、13C 雙標(biāo)記PfCP-2.9蛋白及15N 單標(biāo)記PfMSP119蛋白，用于NMR分析。在制備樣本的過程中，我們遇到了蛋白降解和表達(dá)量低等問題。通過采用小型罐發(fā)酵以及嚴(yán)格控制和優(yōu)化發(fā)酵條件等途徑，獲得了用于磁共振分析的蛋白樣品。HNCA，HNCACB，CBCA(CO)NH，HNCO和HN(CA)CO 實(shí)驗(yàn)被用來進(jìn)行主

9、鏈原子信號指認(rèn)；HBHA(CO)NH，(H)CC(CO) NH，CC(CO)NH和15N-TOCSY-HSQC實(shí)驗(yàn)被用來進(jìn)行側(cè)鏈原子信號指認(rèn)。對主鏈碳原子的指認(rèn)獲得的數(shù)據(jù)如下：分別指認(rèn)了PfAMA1-III、連接區(qū)、PfMSP119 部分的39個、12個和71個氨基酸殘基；同時獲得了部分側(cè)鏈的化學(xué)位移數(shù)據(jù)。PfAMA1-III 部分被指認(rèn)的殘基定位分散于分子的不同區(qū)域，包含有結(jié)構(gòu)區(qū)域和無序區(qū)域，且許多位于核心結(jié)構(gòu)區(qū)的殘基被指認(rèn)；PfMS

10、P119部分大多數(shù)氨基酸殘基均被指認(rèn)。
　　 三維15N-標(biāo)記 NOESY-HSQC 波譜實(shí)驗(yàn)用來分析化學(xué)位移。絕大多數(shù)PfCP-2.9分子中被指認(rèn)的氨基酸殘基表現(xiàn)出的化學(xué)位移與已報道的單個組分的化學(xué)位移高度相似。僅有少量氨基酸的化學(xué)位移與已報道的數(shù)據(jù)有較大差異，由于在已報道的PfAMA1-III和PfMSP119的NMR 研究中，與本項(xiàng)研究使用的緩沖液條件不同，因此這些差異被考慮為實(shí)驗(yàn)條件差異所致。
　　 將PfCP-

11、2.9與PfMSP119的HSQC 圖譜進(jìn)行重疊，結(jié)果顯示PfCP-2.9分子中的PfMSP119的結(jié)構(gòu)與單獨(dú)的PfMSP119分子的結(jié)構(gòu)完全一致。除了His150和Ser238 殘基，所有氨基酸殘基的化學(xué)位移峰的差別都在實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)。His150和Ser238 殘基分別位于兩種分子的N 端和C 端，易受樣品條件不同的影響。經(jīng)過對比兩種分子的波譜圖，未發(fā)現(xiàn)任何信號消失。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)有力地證明了PfCP-2.9分子中的PfMSP119 部

12、分的結(jié)構(gòu)與單獨(dú)的PfMSP119分子的結(jié)構(gòu)完全一致。
　　 將15N 單標(biāo)記PfCP-2.9與PfMSP119 同時進(jìn)行橫向馳豫率的測定，結(jié)果顯示，位于PfCP-2.9分子的氨基酸殘基的橫向馳豫率整體較高，這是因?yàn)镻fCP-2.9分子具有較高的分子量和較慢的分子翻轉(zhuǎn)。將兩種分子中的數(shù)據(jù)進(jìn)行重疊，發(fā)現(xiàn)兩者有極高的相似度，未在任何區(qū)域發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。該結(jié)果提示PfCP-2.9分子中的PfMSP119 部分與單獨(dú)的PfMSP119分子相

13、比，沒有氨基酸殘基化學(xué)或構(gòu)象的變化，提示PfMSP119部分與PfAMA1-III 部分和連接區(qū)部分無微弱的相互作用。
　　 （二）多期聯(lián)合瘧疾疫苗免疫學(xué)及臨床前研究
　　 為研制多期聯(lián)合瘧疾疫苗，本實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建了惡性瘧原蟲紅外期抗原PfCSP-2。該抗原由由惡性瘧原蟲3D7株的環(huán)子孢子蛋白（CSP）的NANP 重復(fù)區(qū)及C 端部分側(cè)翼序列融合而成。在前期的實(shí)驗(yàn)中，該疫苗候選抗原也顯示出良好的發(fā)展前景，包括在畢氏酵母分

14、泌表達(dá)系統(tǒng)中高水平表達(dá)、蛋白可溶和穩(wěn)定性高、純化制備簡便，并在小鼠、家兔動物模型中均顯示出很高的免疫原性等。在此基礎(chǔ)上本研究開展了多期聯(lián)合疫苗多種動物的免疫學(xué)、新型佐劑以及臨床前相關(guān)研究：
　　 1.新型佐劑選用：疫苗的組成包括兩個方面，一是抗原，二是佐劑。作為疫苗，佐劑的作用與抗原同等重要，特別是目前尚缺乏人用強(qiáng)效佐劑。為此，本項(xiàng)研究選用了5種人用疫苗佐劑或組合：MF59、GLA、MF59+GLA、鋁佐劑+GLA、鋁佐劑+Cp

15、G，并在小鼠和恒河猴體內(nèi)進(jìn)行了佐劑比較研究。
　　 BALB/c小鼠8組，每組8只小鼠，分別免疫M(jìn)F59+GLA、MF59、GLA、ISA720、弗氏佐劑、鋁佐劑、鋁佐劑+GLA與PfCP-2.9蛋白的疫苗制劑。頸背部皮下注射共免疫3次，每次免疫后取血。采用ELISA 方法檢測免疫血清的特異性抗體水平，結(jié)果顯示除了弗氏佐劑和ISA720兩種非人用佐劑外，鋁佐劑＋GLA＋抗原組特異性抗體水平最高，從該組免疫血清中純化的抗體顯示出一

16、定的體外抑制原蟲生長效力。
　　 恒河猴5組，每組3只恒河猴，分別免疫ISA720、鋁佐劑+CpG、鋁佐劑+GLA、鋁佐劑、MF59+GLA與PfCP-2.9+PfCSP-2蛋白的疫苗制劑。大腿肌肉注射共免疫3次，每次免疫后取血。采用ELISA 方法檢測免疫血清的特異性抗體水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鋁佐劑+GLA組PfCP-2.9 特異性抗體水平最高，其純化的抗體顯示出明顯的體外抑制瘧原蟲生長效力。
　　 綜合考慮目前在臨床前及

17、臨床試驗(yàn)中佐劑應(yīng)用的實(shí)際情況和佐劑的安全性等問題，以及佐劑的實(shí)際效果需要在臨床試驗(yàn)中才能體現(xiàn)等實(shí)際情況，經(jīng)與世界衛(wèi)生組織和美國IDRI 專家研討，確定鋁佐劑＋GLA為本疫苗的佐劑。
　　 2.兩種抗原劑量配比：在實(shí)際應(yīng)用時，多期聯(lián)合瘧疾疫苗面臨著兩種抗原劑量如何配比的問題，為此我們在小鼠模型中進(jìn)行了最佳劑量配比實(shí)驗(yàn)。BALB/c小鼠5組，每組6只小鼠，PfCP-2.9:PfCSP-2的量分別為1:1、1:2、2:1、1:4、4:

18、1。頸背部皮下注射共免疫3次，每次免疫后取血。采用ELISA 方法檢測免疫血清的特異性抗體水平，結(jié)果顯示抗原配比1:1組PfCP-2.9抗體水平略高，其次為4:1、2:1、1:2、1:4組，統(tǒng)計(jì)分析顯示各組間均無顯著差異；第1～4組PfCSP-2抗體水平接近，以抗原配比1:2組略高，其次為1:4、1:1、2:1組，4:1組抗體水平明顯較低，統(tǒng)計(jì)分析顯示第1:2、1:4、1:1、2:1組間無顯著差異，但均明顯高于4:1組（p<0.05）。

19、綜合上述結(jié)果，我們確定兩種抗原以1:1配比進(jìn)行下階段的實(shí)驗(yàn)。
　　 3.兩種抗原相互競爭性抑制分析：為了分析PfCP-2.9與PfCSP-2抗原聯(lián)合免疫時是否存在相互競爭性抑制作用，我們在小鼠和家兔動物模型中進(jìn)行了分析。BALB/c小鼠4組，每組6只小鼠；家兔4組，每組5只家兔，分組包括：PfCP-2.9組、PfCSP-2組、PfCP-2.9+PfCSP-2 聯(lián)合組合生理鹽水對照組。頸背部皮下注射共免疫3次，每次免疫后取血。采用

20、ELISA 方法檢測免疫血清的特異性抗體水平，結(jié)果顯示單獨(dú)的抗原組與聯(lián)合抗原組產(chǎn)生的特異性抗體水平接近，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析均無顯著差異，表明兩種抗原聯(lián)合免疫無明顯競爭性抑制作用。
　　 4.免疫原性及體外抑制效力分析：在確定了合適的佐劑、合適的抗原劑量配比和證實(shí)了抗原之間無相互競爭性抑制作用的基礎(chǔ)上，我們在小鼠、家兔和恒河猴動物模型中開展了由新型佐劑多期與兩個疫苗抗原組成的聯(lián)合瘧疾疫苗（PfCP-2.9+PfCSP-2/Al+GLA）的

21、免疫原性實(shí)驗(yàn)以及體外抑制原蟲生長效力的分析。
　　 BALB/c小鼠4組，每組6只小鼠，分組包括：PfCP-2.9+PfCSP-2/Al+GLA組、Al+GLA對照組、PfCP-2.9+PfCSP-2/Al組、Al對照組；家兔4組，每組5只家兔，分組包括：PfCP-2.9組、PfCSP-2組、PfCP-2.9+PfCSP-2 聯(lián)合組合生理鹽水對照組；恒河猴2組，每組5只恒河猴，分組包括：PfCP-2.9+PfCSP-2/Al+G

22、LA組、PfCP-2.9+PfCSP-2/Al組；頸背部皮下或肌肉注射共免疫3次，每次免疫后取血。采用ELISA 方法檢測免疫血清的特異性抗體水平，結(jié)果在小鼠、家兔和恒河猴動物模型中，該疫苗均顯示出良好的免疫原性，能刺激動物產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，聯(lián)合佐劑Al+GLA 較單獨(dú)Al佐劑組抗體水平高，免疫血清能識別天然抗原，并在體外顯示出一定的抑制瘧原蟲生長效力。
　　 5. 疫苗穩(wěn)定性初步觀察：為了觀察該新型多期聯(lián)合瘧疾疫苗的穩(wěn)

23、定性，我們采用以引起動物免疫應(yīng)答的效力進(jìn)行評估，即測定半數(shù)有效劑量ED50。該方法是將多價多期聯(lián)合瘧疾疫苗抗原保存在4℃和37℃條件下，取不同時間點(diǎn)的多價多期聯(lián)合瘧疾疫苗抗原，連續(xù)稀釋5個稀釋度，與鋁+GLA 佐劑混合后接種BALB/c小鼠，每個稀釋度10只，雌雄各半。4周后采血取血清，用ELISA 法測定血清樣本，計(jì)算ED50值。結(jié)果顯示，4℃條件下6個月內(nèi)和37℃條件下7天內(nèi)的疫苗樣品，其半數(shù)有效劑量ED50保持在穩(wěn)定水平，無顯著差

24、異，表明疫苗抗原在凍干狀態(tài)下至少能在4℃條件下6個月內(nèi)和37℃條件下7天內(nèi)保持其免疫效力的穩(wěn)定。
　　 小結(jié)：多期聯(lián)合瘧疾疫苗是有希望的瘧防新措施，在本實(shí)驗(yàn)室對瘧疾疫苗長期研究的基礎(chǔ)上，本項(xiàng)研究開展了對PfCP-2.9 疫苗候選抗原的結(jié)構(gòu)解析和多期聯(lián)合瘧疾疫苗免疫學(xué)及臨床前研究。結(jié)果顯示：（1）AMA1-III和MSP119在PfCP-2.9分子中均具有良好的結(jié)構(gòu)，并維持了其天然構(gòu)象；（2）PfCP-2.9分子中的AMA1-II

25、I和MSP119組分無相互作用；（3）比較了多種人用佐劑的作用，選擇了Al+GLA作為新型疫苗的佐劑；（4）PfCP-2.9與PfCSP-2兩種抗原1:1是合適的抗原配比；兩種抗原在聯(lián)合應(yīng)用時無明顯的競爭性抑制作用；（5）新型多期聯(lián)合瘧疾疫苗PfCP-2.9+PfCSP-2/Al+GLA在小鼠、家兔和恒河猴動物模型中均顯示出良好的免疫原性，其抗體顯示出一定的體外抑制原蟲生長效果；（6）兩種抗原制劑在凍干狀態(tài)下，至少能在4℃條件下6個月內(nèi)