白介素--12p35對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)小鼠高血壓心肌肥厚炎癥和自噬的影響.pdf

1、目的:
　　該實(shí)驗(yàn)使用C57BL/6J背景的野生型(wild-type，WT)小鼠和白介素-12p35基因敲除(interleukin-12p35knockout，IL-12p35-KO)小鼠復(fù)制血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)所致的高血壓心肌肥厚模型，研究心肌肥厚發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中IL-12p35的表達(dá)情況，探討IL-12p35基因缺失對(duì)心肌肥厚過(guò)程中的炎癥和自噬調(diào)節(jié)作用，為臨床治療高血壓所致心肌肥厚提供新的治療

2、靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分組:10-12周雄性野生型C57BL/6J16只，隨機(jī)分成2組，每組8只，A組:陰性對(duì)照組，B組:陽(yáng)性對(duì)照組;10-12周IL-12p35-KO雄性小鼠(C57BL/6J背景)16只，隨機(jī)分成2組，每組8只，C組:實(shí)驗(yàn)組D組:條件對(duì)照組。
　　2.血壓監(jiān)測(cè):使用小動(dòng)物血壓測(cè)量?jī)x(BP-98A，Softron，Japan)進(jìn)行尾動(dòng)脈測(cè)量血壓和心率。
　　3.心臟超聲:使用

3、小動(dòng)物超聲儀(Visual Sonics Vevo2100)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。
　　4.心肌肥厚的檢測(cè):Real-time PCR檢測(cè)心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)、Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)的表達(dá)。
　　5.心肌體重指數(shù):心肌質(zhì)量/體重(Heart weight/Body weight，HW/BW)觀察心肌

4、肥厚情況。
　　6.心肌纖維化:使用Masson三色特殊染色法檢測(cè)心肌組織纖維化程度。
　　7.心肌炎癥浸潤(rùn):使用蘇木精和伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色觀察炎癥的浸潤(rùn)情況，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)CD3、CD68的表達(dá)。
　　8.自噬的檢測(cè):使用蛋白免疫印記(Western Blot，WB)和免疫組化化學(xué)染色檢測(cè)微管相關(guān)蛋白-1輕鏈3(Microtubule-associated prote

5、in1light chain3，LC3)、p62的表達(dá)。
　　9.心肌肥厚IL-12p35的表達(dá):Real-time PCR檢測(cè)IL-12p35。
　　10.信號(hào)通路:使用WB檢測(cè)JAK2/STAT4(signal transducers and activators of transcription)通道磷酸化情況，進(jìn)行下游通路機(jī)制的研究。
　　11.統(tǒng)計(jì):使用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)都以均數(shù)

6、±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間的比較采用t檢驗(yàn)，多組之間比較采用one-way ANOVA，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.001為有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　在AngⅡ灌注前4組的基礎(chǔ)血壓沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，AngⅡ灌注后3天血壓開始升高，在第3周達(dá)到峰值，持續(xù)至第4周，并且心臟超聲和心肌肥厚標(biāo)志物:ANP、BNP、Collagen InRNA的檢測(cè)表明高血壓心肌肥厚建模成功，其中

7、IL-12p35-KO+AngⅡ組收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、HW/BW較WT+AngⅡ組明顯升高，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HE、Masson染色反映了AngⅡ微量滲透泵持續(xù)灌注的小鼠，心肌纖維化、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯、心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，肌纖維斷裂，細(xì)胞核畸形、空泡樣變較顯著，其中IL-12p35-KO+AngⅡ組較WT+AngⅡ組明顯，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。持續(xù)的AngⅡ微量滲透泵灌注增加了CD3、CD6

8、8的表達(dá)。IL-12p35基因的缺失使自噬反應(yīng)增強(qiáng)，并且促進(jìn)了JAK2/STAT4信號(hào)通路的磷酸化，而AngⅡ微量滲透泵灌注加重了自噬反應(yīng)和JAK2/STAT4信號(hào)通路的磷酸化。經(jīng)過(guò)AngⅡ微量滲透泵灌注后的小鼠，WT+AngⅡ組小鼠心肌組織中IL-12p35mRNA表達(dá)較WT組明顯升高。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)AngⅡ微量滲透泵灌注建立了高血壓心肌肥厚小鼠模型，研究表明IL-12p35基因的缺失可以促使血壓更高，增大HW/B

9、W，加重炎癥浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂、肌纖維斷裂、細(xì)胞核畸形、空泡樣變和自噬水平，同時(shí)也可以激活JAK2/STAT4信號(hào)通路的磷酸化，并且WT+AngⅡ組小鼠心肌組織中IL-12p35mRNA表達(dá)較WT組明顯升高。說(shuō)明IL-12p35基因不僅參與了AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓心肌肥厚的病理過(guò)程，而且還具有抑制炎癥和調(diào)控自噬的效應(yīng)，并且這些生物學(xué)效應(yīng)可能是由JAK2/STAT4信號(hào)通路介導(dǎo)的。由此可見(jiàn)IL-12p35可能成為防治高血壓所致心肌