低氧對神經(jīng)干細(xì)胞中miR-210的表達(dá)調(diào)控及功能研究.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells,NSCs)是存在于胚胎期神經(jīng)系統(tǒng)和成體腦組織中的一類具有自我更新和分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞不僅對胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育至關(guān)重要,也為各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和疾病的治療帶來了希望。通過移植神經(jīng)干細(xì)胞可以在動物或人體中治療帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、阿茲海默癥、多發(fā)性硬化癥、中風(fēng)和脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前,神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增通常是在常

2、氧即20％的氧濃度條件下進(jìn)行的,而胚胎發(fā)育和成體腦組織中的氧濃度只有3-5%,甚至更低,這種現(xiàn)象被稱作“生理性低氧”。近年來,越來越多的實驗證據(jù)表明低氧對于神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。本實驗室的研究結(jié)果表明,適度低氧能促進(jìn)成年動物腦內(nèi)和離體培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。因此,研究低氧對神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖和分化的調(diào)控具有重要的意義。
　　低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor,HIF)作為細(xì)胞和

3、分子水平的低氧感知分子是低氧信號通路中關(guān)鍵的調(diào)控分子之一。低氧條件下,細(xì)胞中的HIF-1α穩(wěn)定并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,通過與低氧反應(yīng)元件(Hypoxia responsive element,HRE)結(jié)合調(diào)控多種下游靶基因的表達(dá),從而調(diào)控細(xì)胞存活、增殖和分化等生物學(xué)過程。最新的研究發(fā)現(xiàn)microRNAs參與HIF信號通路的調(diào)控。低氧下HIF-1α能上調(diào)多種miRNAs的表達(dá)如miR-23,miR-24,miR-26,miR-107,miR-21

4、0和miR-373等,而miR-199和miR-20b則能調(diào)控HIF-1α的表達(dá)。miR-210在現(xiàn)有報道的所有低氧處理的細(xì)胞中均一致表達(dá)上調(diào),而且上調(diào)最為顯著,被認(rèn)為是低氧標(biāo)志性microRNA?，F(xiàn)有研究證明HIF-1?能夠與miR-210轉(zhuǎn)錄起始位點上游40bp處的低氧反應(yīng)元件結(jié)合,進(jìn)而調(diào)控miR-210的表達(dá)。miR-210通過其靶基因參與對細(xì)胞存活、凋亡、線粒體代謝、DNA損傷修復(fù)和血管生成等生物學(xué)過程的調(diào)控。然而,miR-21

5、0在神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)及調(diào)節(jié)機(jī)制尚未見報道。因此,在該研究中我們探討了低氧對神經(jīng)干細(xì)胞中miR-210的表達(dá)調(diào)控和作用機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　一、低氧對神經(jīng)干細(xì)胞中miR-210的表達(dá)調(diào)控及功能研究
　　1.將離體NSCs置于三個氧濃度下培養(yǎng)1、2、3天,然后用Realtime-PCR檢測NSCs中miR-210表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)3%和0.3%低氧能顯著促進(jìn)NSCs中miR-210的表達(dá),并且隨著低氧時間的延長和氧濃度的降低

6、miR-210的表達(dá)量逐漸增高,提示miR-210在NSCs中可能具有重要的生物學(xué)作用。
　　2.用DNA甲基化抑制劑AZA抑制DNA甲基化,能在常氧(20%)和低氧(3%,0.3%)下顯著上調(diào)NSCs中miR-210的表達(dá),說明DNA甲基化可能參與了miR-210的表達(dá)調(diào)控,而且這一調(diào)控通路不依賴HIF-1通路。
　　3.通過在神經(jīng)干細(xì)胞中過表達(dá)或抑制miR-210然后檢測其對細(xì)胞存活、凋亡和增殖的影響,結(jié)果顯示miR-2

7、10可以顯著抑制缺氧(0.3%)引起的細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞存活,而不影響細(xì)胞增殖。
　　4.為了進(jìn)一步探討miR-210作用的分子機(jī)制,通過生物信息學(xué)篩選與細(xì)胞存活和凋亡相關(guān)的靶基因,發(fā)現(xiàn)促凋亡蛋白BNIP3的編碼區(qū)和3’UTR有兩個可以和miR-210結(jié)合的種子序列,可能是miR-210的靶基因。
　　5.通過過表達(dá)和抑制miR-210,發(fā)現(xiàn)miR-210能顯著抑制BNIP3蛋白的表達(dá)。將BNIP3mRNA編碼區(qū)和3’UTR

8、的兩個可能與miR-210結(jié)合的互補(bǔ)位點構(gòu)建到熒光素酶報告載體,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-210能顯著抑制這兩個質(zhì)粒的熒光素酶活性,而將這兩個位點突變后能反轉(zhuǎn)miR-210的抑制作用,說明BNIP3是miR-210的靶基因。
　　6.通過BNIP3siRNA特異抑制BNIP3能顯著減少低氧下miR-210inhibitor導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡,說明miR-210—BNIP3在低氧下NSCs中發(fā)揮了關(guān)鍵的抗凋亡作用。
　　7.通過核漿分離W

9、estern Blot和免疫熒光實驗證明miR-210能夠抑制促凋亡蛋白AIF入核,進(jìn)而抑制了缺氧下神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡。
　　二、低氧對循環(huán)miR-210的分泌調(diào)控及其初步的功能研究
　　最新的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可以被細(xì)胞分泌到胞外,進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)液和體液循環(huán)系統(tǒng)。這種被膜結(jié)構(gòu)和蛋白包裹的分泌形式的miRNAs被稱為循環(huán)miRNAs。由于血漿中的循環(huán)miRNA具有穩(wěn)定、易于獲得和便于檢測的特點,使其成為理想的疾病診斷的標(biāo)志分子

10、而受到廣泛的專注。然而,循環(huán)miRNAs的功能研究目前少有報道。在此,我們觀察了低氧處理神經(jīng)干細(xì)胞后對循環(huán)miR-210分泌的影響和循環(huán)miR-210對神經(jīng)干細(xì)胞存活的作用。
　　1.通過Realtime-PCR檢測三種氧濃度下NSCs培養(yǎng)了不同時間后,NSCs中和其培養(yǎng)液中miR-210的含量,結(jié)果顯示低氧在促進(jìn)NSCs中miR-210表達(dá)的同時,NSCs培養(yǎng)液中循環(huán)miR-210的含量也顯著上調(diào),并且具有氧濃度和低氧時間依賴性

11、。
　　2.通過超速離心的方法分離了含有循環(huán)miR-210的外來體(exosomes)和微囊(microvesicles),并用電鏡觀察了exosomes的超微結(jié)構(gòu)。熒光染料特異染色實驗表明外來體和微囊可以被受體細(xì)胞吸收。囊泡中的循環(huán)miR-210可以進(jìn)入受體細(xì)胞,上調(diào)細(xì)胞中miR-210含量。
　　3.將三種氧濃度下收集的NSCs培養(yǎng)液作用于常氧下的NSCs,并檢測細(xì)胞存活發(fā)現(xiàn)3%氧濃度下的NSCs培養(yǎng)液能促進(jìn)NSCs存活

12、,而0.3%氧濃度下的NSCs培養(yǎng)液能抑制NSCs存活,在兩種培養(yǎng)液中加入miR-210antagomir能反轉(zhuǎn)循環(huán)miR-210對細(xì)胞存活的作用,說明NSCs培養(yǎng)液中含有的循環(huán)miR-210可以調(diào)節(jié)細(xì)胞存活。
　　4.將含有梯度濃度循環(huán)miR-210的培養(yǎng)液作用于常氧下的NSCs,并檢測細(xì)胞存活發(fā)現(xiàn),循環(huán)miR-210對細(xì)胞存活的作用與其濃度有關(guān),高濃度的循環(huán)miR-210對NSCs的存活有抑制作用,而低濃度的循環(huán)miR-210

13、對NSCs存活的作用還需要進(jìn)一步驗證。
　　5.將SD大鼠進(jìn)行模擬高原5000米低壓低氧處理0.5-2小時,然后通過Realtime-PCR檢測大鼠血漿和腦脊液中miR-210的含量,結(jié)果表明低壓低氧能顯著促進(jìn)大鼠血漿和腦脊液中循環(huán)miR-210含量增加。因此,血漿中循環(huán)miR-210的增加有可能作為高原低氧的標(biāo)志分子,其具體作用和機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。
　　綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn):
　　(1)低氧能顯著上調(diào)NSCs中mi

14、R-210的表達(dá)量;
　　(2)DNA甲基化參與調(diào)控miR-210的表達(dá),并且獨立于HIF-1通路;
　　(3)低氧下miR-210具有促進(jìn)NSCs存活,抑制細(xì)胞凋亡的作用;
　　(4)BNIP3是miR-210的靶基因,miR-210通過抑制BNIP3的表達(dá),進(jìn)而抑制AIF入核,最終抑制了缺氧時NSCs的凋亡;
　　(5)低氧能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分泌miR-210;
　　(6)循環(huán)miR-210可以影響NSC