抗HBV多聚酶TP區(qū)細(xì)胞內(nèi)VH抗體體外抑制HBV復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 為了研究抗HBV多聚酶TP區(qū)特異性VH抗體體外抑制HBV的復(fù)制與分泌，把HBV多聚酶TP區(qū)作為一個(gè)靶抗原，通過特異性VH抗體中和其功能，實(shí)際探討特異性VH抗體在體外抑制HBV的復(fù)制與分泌。 方法 1.在酵母表達(dá)scFv抗體庫中抽提表達(dá)載體釀酒酵母中的質(zhì)粒pPNL-6。用PCR的方法把scFv抗體庫轉(zhuǎn)變?yōu)閂H抗體庫并備份完整的酵母表達(dá)scFv抗體庫。 2.把mDHFR基因分割成兩部分，其中mDHFR(

2、1)表示mDHFR基因氨基端1aa-109aa序列，mDHFR(2)表示mDHFR基因羧基端110aa-190aa序列。把HBVTP區(qū)作為靶抗原，分別構(gòu)建PCA方法中抗原載體pET-antigen-mDHFR(2)和抗體載體pET-antibody-mDHFR(1)，其中抗體載體為酶連反應(yīng)體系混合物。 3.用PCA方法在VH抗體庫中選擇針對(duì)HBVTP區(qū)的特異性抗體：用化學(xué)法把抗原載體pET-antigen-mDHFR(2)轉(zhuǎn)化入

3、大腸埃希菌菌株BL21(DE3)pLysS，即BL21(DE3)pLysS-antigen。再用電擊轉(zhuǎn)化法把抗體載體pET-antibody-mDHFR(1)轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)pLysS-antigen。共轉(zhuǎn)化40次以完成抗體庫的轉(zhuǎn)化。把電擊轉(zhuǎn)化的細(xì)菌轉(zhuǎn)入SOC培養(yǎng)基孵育30min后，PBS洗滌2次，以徹底清除殘留的SOC培養(yǎng)基。鋪板于M9選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行30℃、24-72h培養(yǎng)，存活細(xì)菌即為陽性克隆。 4.從

4、選擇出的所有抗體中用TMP(trimethoprim，TMP，甲氧芐胺嘧啶)濃度梯度方法篩選出與抗原親和力最高的抗體：把選擇出的帶有抗原、抗體質(zhì)粒的大腸埃希菌BL21(DE3)pLysS陽性克隆分別接種于含有10mg/LTMP、100mg/LTMP和1000mg/LTMP濃度的M9選擇培養(yǎng)基，只有含有與抗原親和力最高抗體的大腸埃希菌能在最高濃度的TMP中存活。 5.構(gòu)建在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)特異性VH1抗體的載體：pZeoSV2(+)

5、-VH1?；蛐蛄薪?jīng)測(cè)序鑒定。其中VH1抗體即為與HBVTP區(qū)親和力最高的抗體。 6.pZeoSV2(+)-VH1經(jīng)脂質(zhì)體包裹法轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分三組：無DNA轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞(A組)；轉(zhuǎn)染空裁體pZeoSV2(+)的HepG2.2.15細(xì)胞(B組)；轉(zhuǎn)染pZeoSV2(+)-VH1的HepG2.2.15細(xì)胞(C組)。DNA轉(zhuǎn)染后，在LightcyclerPCR熒光定量分析儀上分別檢測(cè)各組培養(yǎng)細(xì)胞

6、上清及培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)HBVDNA含量。 7.L02細(xì)胞的培養(yǎng)及L02細(xì)胞實(shí)驗(yàn)感染HBV：感染血清為第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍感染病研究所住院病人血清(均為慢性乙型病毒性肝炎患者，HBsAg+，HBeAg+，anti-HBc+，其他嗜肝病毒標(biāo)志物為陰性)，血清混合，PCR定量檢測(cè)HBVDNA含量為108copies/ml。 8.L02細(xì)胞實(shí)驗(yàn)感染HBV后用PCR擴(kuò)增HBcAg基因，蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)L02細(xì)胞實(shí)驗(yàn)感染HBV后HBcA

7、g表達(dá)。以證實(shí)L02細(xì)胞不僅成功感染了HBV，而且細(xì)胞內(nèi)有HBV病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)。 9.pZeoSV2(+)-VH1經(jīng)脂質(zhì)體包裹法轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)感染HBV的L02細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分三組：無DNA轉(zhuǎn)染的L02細(xì)胞(A組)；轉(zhuǎn)染空載體pZeoSV2(+)的L02細(xì)胞(B組)；轉(zhuǎn)染pZeoSV2(+)-VH1的L02細(xì)胞(C組)。 10.對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，分析HBVTP區(qū)特異性VH1抗體對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)感染HBV的

8、L02細(xì)胞分泌HBV的抑制作用。 結(jié)果 1.VH抗體庫的建立：在酵母表達(dá)scFv抗體庫(包含有超過1010個(gè)scFv抗體)中抽提出表達(dá)載體釀酒酵母中的質(zhì)粒pPNL-6。用PCR的方法把scFv抗體庫轉(zhuǎn)變?yōu)閂H抗體庫。VH抗體庫的多樣性要比scFv抗體庫的多樣性小的多，因此足夠的庫容可以保證從抗體庫中直接篩選到高親和力的抗體。 2.從抗體庫中選擇特異性抗體的PCA方法的建立：從抗體庫中選擇特異性抗體目前有很多方法，

9、如噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、酵母雙雜交技術(shù)等。這些方法各有利弊，但從我們的實(shí)驗(yàn)中可以看出PCA方法在抗體選擇中顯示出很多優(yōu)點(diǎn)：作為與抗體結(jié)合的抗原不需要表達(dá)與純化，只需要抗原的基因，這大大減少了實(shí)驗(yàn)難度；由于抗原抗體的結(jié)合是在細(xì)胞內(nèi)自然環(huán)境下發(fā)生，與選擇出的特異性抗體發(fā)揮作用的環(huán)境一致。 3.提高電轉(zhuǎn)化效率和優(yōu)化電轉(zhuǎn)化參數(shù)：只有高的轉(zhuǎn)化效率才能保證陽性克隆的選擇，而不同的感受態(tài)細(xì)菌需要優(yōu)化出不同的電擊轉(zhuǎn)化條件。制作的感受態(tài)

10、大腸埃希菌BL21(DE3)pLysS-antigen的轉(zhuǎn)化效率為1.7×109cfu/μgDNA。但培養(yǎng)基中加入抗生素后，轉(zhuǎn)化效率明顯降低，如氨芐青霉素可使轉(zhuǎn)化效率降低到原來的1/103。對(duì)于感受態(tài)大腸埃希菌BL21(DE3)pLysS-antigen優(yōu)化出的電轉(zhuǎn)化參數(shù)，電壓：1.5KV(15KV/cm)；電容：25μf；電阻：200Ω；電擊時(shí)間：4.0msec～4.2msec。 4.用PCA方法從VH抗體庫中選擇出HBV多聚

11、酶TP區(qū)特異性抗體：從VH抗體庫中選擇出三個(gè)HBVTP區(qū)特異性VH抗體：VH1、VH2和VH3。根據(jù)抗體的DNA序列和WernerMüller數(shù)據(jù)庫標(biāo)明了3個(gè)抗體的氨基酸序列和各功能區(qū)的位置。 5.在3個(gè)抗體中選擇出與HBV多聚酶TP區(qū)親和力最高的抗體：把選擇出的帶有抗原、抗體質(zhì)粒的大腸埃希菌BL21(DE3)pLysS分別接種于含有10mg/LTMP、100mg/LTMP和1000mg/LTMP濃度的M9選擇培養(yǎng)基，只有含有V

12、H1的大腸埃希菌能在最高濃度的TMP中存活，故認(rèn)為VH1抗體與抗原的親和力最高。 6.L02細(xì)胞成功感染HBV及表達(dá)相關(guān)病毒蛋白：L02細(xì)胞實(shí)驗(yàn)感染HBV后用PCR擴(kuò)增HBcAg基因，只有感染HBV的L02細(xì)胞為模板可以擴(kuò)增出HBcAg基因，結(jié)果與陽性對(duì)照一致；而且在L02細(xì)胞實(shí)驗(yàn)感染HBV的過程中，用最后一次PBS漂洗液為模板并不能擴(kuò)增出HBcAg基因，保證了L02細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV實(shí)驗(yàn)感染血清徹底洗脫。以上結(jié)果說明L02細(xì)胞

13、成功感染了HBV。蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)L02細(xì)胞實(shí)驗(yàn)感染HBV后HBcAg表達(dá)，而未感染HBV的L02細(xì)胞未能檢測(cè)到HBcAg的表達(dá)，以上結(jié)果說明L02細(xì)胞不僅成功感染了HBV，而且細(xì)胞內(nèi)有HBV病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)。倒置顯微鏡下觀察L02細(xì)胞實(shí)驗(yàn)感染HBV前后無明顯差異。 7.HBV多聚酶TP區(qū)VH1抗體可以抑制HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBV病毒顆粒：構(gòu)建真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)特異性VH1抗體的載體pZeoSV2(+)-VH1完成后，pZe

14、oSV2(+)-VH1轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pZeoSV2(+)-VH1的HepG2.2.15細(xì)胞(C組)比沒有轉(zhuǎn)染pZeoSV2(+)-VH1或只轉(zhuǎn)染空載體pZeoSV2(+)的HepG2.2.15細(xì)胞(A，B組)分泌病毒顆粒明顯減少(上清內(nèi)：2.9787±0.2761vs5.1504±0.2761，5.2951±0.2410，p＜0.05；細(xì)胞內(nèi)：5.2839±0.1629vs8.3004±0.3232，8.5321±0

15、.1383，p＜0.05)。倒置顯微鏡下觀察HepG2.2.15細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNA前后無明顯差異。 8.HBV多聚酶TP區(qū)VH1抗體可以抑制實(shí)驗(yàn)感染HBV的L02細(xì)胞分泌HBV病毒顆粒：pZeoSV2(+)-VH1轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)感染HBV的L02細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pZeoSV2(+)-VH1的L02細(xì)胞(C組)比沒有轉(zhuǎn)染pZeoSV2(+)-VH1或只轉(zhuǎn)染空載體pZeoSV2(+)的L02細(xì)胞(A，B組)分泌病毒顆粒明顯減少(細(xì)胞內(nèi)：3.0259

16、±0.1083vs5.3601±0.7312，5.3608±0.2116，p＜0.05)。在實(shí)驗(yàn)中由于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pZeoSV2(+)-VH1后的L02細(xì)胞(已感染HBV)培養(yǎng)上清中HBVDNA濃度較低，低于檢測(cè)下限(＜103copies/ml)，因此無法用HBVDNA水平來比較上述幾組培養(yǎng)細(xì)胞上清內(nèi)HBVDNA含量的差異。倒置顯微鏡下觀察L02細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNA前后無明顯差異。 結(jié)論 1.VH抗體庫的建立：用PCR的方法把酵母

17、展示scFv抗體庫轉(zhuǎn)變?yōu)閂H抗體庫。VH抗體庫的多樣性要比scFv抗體庫的多樣性小的多，因此足夠的庫容可以保證從抗體庫中直接篩選到高親和力的抗體。 2.從抗體庫中選擇特異性抗體的PCA方法的建立：PCA作為從抗體庫中選擇特異性抗體的一種方法，在抗體選擇中顯示出很多優(yōu)點(diǎn)。作為與抗體結(jié)合的抗原不需要表達(dá)與純化，只需要抗原的基因，這大大減少了實(shí)驗(yàn)難度；由于抗原抗體的結(jié)合是在細(xì)胞內(nèi)自然環(huán)境下發(fā)生，與選擇出的特異性抗體發(fā)揮作用的環(huán)境一致；