DDX17調(diào)控HBV復制的分子機制.pdf

1、目的：HBV感染過程是病毒與宿主因子發(fā)生相互作用、相互影響的過程。在抵御病毒感染方面，一些細胞內(nèi)宿主因子具有抗病毒效應，從而對宿主免疫系統(tǒng)有補充作用。DExD/H-box家族蛋白是RNA解旋酶家族中重要亞家族。有研究報道該家族中一些成員可參與抵抗病毒感染。然而關于DExD/H-box家族蛋白在HBV復制調(diào)控中作用的報道非常有限。本研究篩選了可抑制HBV復制的DExD/H-box家族成員，并對其中的DDX17在HBV復制調(diào)控中的作用及分子

2、機制進行了研究。
　　方法：
　　1.通過NCBI/BLAST數(shù)據(jù)庫查詢目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的所有DExD/H-box解旋酶家族蛋白種類；
　　2.以HepG2細胞來源cDNA為模板，利用RT-PCR方法，分別擴增DExD/H-box家族基因家族基因，并將目的基因片段連接至載體pCH9；
　　3.構建HBV核心啟動子熒光素酶報告基因pCH9-pcore-Rluc；
　　4.在HepG2細胞中，分別共轉(zhuǎn)染各種目的基因

3、表達質(zhì)粒與pCH9-pcore-Rluc或空載體與pCH9-pcore-Rluc，轉(zhuǎn)染48h后收集細胞進行熒光素酶報告檢測；
　　5.使用Western blot檢測方法鑒定DDX17在HepG2細胞中過表達水平；
　　6.使用Southern blot檢測方法鑒定過表達DDX17對HepG2細胞中HBV復制中間體表達水平的影響；
　　7.使用Western blot檢測方法鑒定DDX17在Huh7細胞中過表達水平；<

4、br>　　8.使用Southern blot檢測方法鑒定過表達DDX17對Huh7細胞中HBV復制中間體表達水平的影響；
　　9.使用Northern blot檢測方法鑒定過表達DDX17對HepG2細胞中HBV轉(zhuǎn)錄水平的影響；
　　10.使用Northern blot檢測方法鑒定過表達DDX17對Huh7細胞中HBV轉(zhuǎn)錄水平的影響；
　　11.通過ELISA方法檢測過表達DDX17對肝癌細胞HepG2上清中HBeAg

5、分泌量的影響；
　　12.通過ELISA方法檢測過表達DDX17對肝癌細胞Huh7上清中HBeAg分泌量的影響；
　　13.通過ELISA方法檢測過表達DDX17對肝癌細胞HepG2上清中HBsAg分泌量的影響；
　　14.通過ELISA方法檢測過表達DDX17對肝癌細胞Huh7上清中HBsAg分泌量的影響；
　　15.通過RT-PCR方法檢測DDX17對ER-α、ZAP或IFN信號途徑中節(jié)點分子表達水平的影響；

6、
　　16.構建DDX17基序Ic和基序II突變體A1004T+C1007G、A1077C+A1086C；
　　17.將質(zhì)粒DDX17TPGRM、DDX17DEADM、wtDDX17或DDX17空載與HBV1.3共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，裂解細胞并進行Southern blot檢測和Northern blot檢測；
　　18.體外轉(zhuǎn)錄HBVε莖環(huán)結構，并與過表達DDX17的細胞蛋白裂解液進行共孵育，進行RNA-Protei

7、n Pull-Down實驗；
　　19.利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建DDX17基因敲除HepG2細胞系，使用測序及Western blot方法鑒定DDX17表達是否缺失；
　　20.在DDX17KO細胞中過表達外源DDX17表達質(zhì)粒，利用Western blot檢測DDX17蛋白表達水平；
　　21.在DDX17KO細胞中共表達DDX17空載體質(zhì)粒與HBV1.3，做Real-time PCR檢測分析和Southe

8、rn blot檢測；
　　22.在DDX17KO和HepG2細胞中分別共轉(zhuǎn)染pCH9-pcore-Rluc和CMV-Fluc，做雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析；
　　23.在HepG2-DDX17KO細胞中，分別共轉(zhuǎn)染DDX17、pCH9-pcore-Rluc與CMV-Fluc或者vector、pCH9-pcore-Rluc與CMV-Fluc做雙熒光素酶報告檢測分析；
　　24.構建HBV核心啟動子截短突變體；
　　25

9、.在HepG2細胞中分別共轉(zhuǎn)上述突變體與CMV-Fluc，做雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析；
　　26.在DDX17KO和HepG2細胞中分別共表達pCH9-BCP-Rluc和CMV-Fluc做雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析；
　　27.在DDX17KO和HepG2細胞中分別共表達pCH9-1636-Rluc和CMV-Fluc、pCH9-1635/1744-Rluc和Fluc做雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析。
　　結果：
　　1.目前已

10、經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人源性DExD/H-box RNA解旋酶有58個，包括16個DHX（DEAH/DExH家族）和42個DDX（DEAD/DExD家族）；
　　2.成功構建27種DExD/H-box RNA解旋酶基因真核細胞表達質(zhì)粒；
　　3.成功構建HBV核心啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒pCH9-pcore-Rluc；
　　4.與對照組相比，DDX17可以顯著負向調(diào)控HBV啟動子活性（P＜0.0001）；
　　5.與對照組相比，

11、在HepG2細胞中轉(zhuǎn)染DDX17表達質(zhì)粒后DDX17蛋白表達水平明顯升高；
　　6.與對照組相比，在HepG2細胞中過表達DDX17后HBV復制中間體表達水平明顯下降；
　　7.與對照組相比，在Huh7細胞中轉(zhuǎn)染DDX17表達質(zhì)粒后DDX17蛋白表達水平明顯升高；
　　8.與對照組相比，在Huh7細胞中過表達DDX17后HBV復制中間體表達水平明顯下降；
　　9.與對照組相比，在HepG2細胞中過表達DDX17后

12、HBV3.5/3.4kb RNA和2.4/2.1kb RNA表達水平均明顯下降；
　　10.與對照組相比，在Huh7細胞中過表達DDX17后HBV3.5/3.4kb RNA和2.4/2.1kb RNA表達水平均明顯下降；
　　11.在HepG2細胞中，與對照組相比，過表達DDX17后HBeAg分泌量顯著低于對照組（P=0.0032）；
　　12.在Huh7細胞中，與對照組相比，過表達DDX17后HBeAg分泌量顯著低于

13、對照組（P＜0.0001）；
　　13.在HepG2細胞中，與對照組相比，過表達DDX17后HBsAg分泌量顯著低于對照組（P=0.0004）；
　　14.在Huh7細胞中，與對照組相比，過表達DDX17后HBsAg分泌量顯著低于對照組（P=0.0035）；
　　15.未發(fā)現(xiàn)過表達DDX17后與對照組中ER-α、ZAP或IFN信號途徑中節(jié)點分子mRNA表達水平有顯著差異；
　　16.成功構建DDX17基序Ic和基

14、序II突變體TPGRM和DEADM；
　　17.突變TPGR結構域后，HBV DNA及HBV RNA水平明顯高于DDX17野生型對照組、而接近空載體對照組；而突變DEAD結構域則未發(fā)現(xiàn)HBV DNA及HBV RNA與DDX17野生型對照組有明顯差異；
　　18.HBV?莖環(huán)并不能直接與DDX17發(fā)生結合；
　　19.成功構建4個HepG2-DDX17KO細胞系；
　　20.DDX17KO細胞本身并不表達DDX17

15、蛋白，外源DDX17表達質(zhì)粒c-Myc-DDX17可以在DDX17KO細胞中正常表達；
　　21.Real-time PCR結果發(fā)現(xiàn)DDX17KO細胞中共轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒與HBV1.3后檢測到的HBV復制中間體表達水皮顯著高于對照細胞系HepG2（P=0.0101），Southern blot結果同樣發(fā)現(xiàn)DDX17KO細胞中共轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒與HBV1.3檢測到的HBV復制中間體表達水平明顯高于對照細胞系HepG2；
　　22.

16、與對照細胞系HepG2相比，DDX17KO細胞中Rluc活性顯著升高（P＜0.0001）；
　　23.與對照組相比，DDX17KO細胞中補充外源DDX17后Rluc活性顯著下降（P=0.0004）；
　　24.成功構建HBV核心啟動子截短突變體；
　　25. DDX17可抑制pCH9-pcore-Rluc啟動子活性，而對截短體，無論是同時缺失Enh I和Enh II，或者缺失Enh I，均表現(xiàn)為正向調(diào)控作用；Enh I

17、的貢獻率超過85%，而Enh II僅達8.5%；并且與對照組相比，過表達DDX17后Enh I貢獻率下降11%，過表達DDX17后Enh II及BCP貢獻率均有小幅度升高；
　　26.與對照細胞系相比，DDX17KO細胞BCP啟動子活性并無顯著差異；
　　27.與對照細胞系相比，DDX17KO細胞中pCH9-1636-Rluc啟動子活性顯著降低（P=0.0256），pCH9-1635/1744-Rluc啟動子活性顯著升高（P