磷脂爬行酶1抑制HBV復制的分子機制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是我國最重大的傳染病之一，HBV感染不僅可以引起急、慢性肝炎，還可導致肝炎、肝硬化和肝癌，在我國約有1.2億HBV攜帶者，其中2000多萬人為慢性乙肝患者。HBV感染和相關疾病嚴重影響患者的健康，同時也給患者家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔?，F(xiàn)在對HBV感染致病機理仍不是很清楚，也沒有對HBV感染特別有效的藥物。目前臨床上廣泛使用的抗HBV藥物包括干擾素(interferon，I

2、FN)和核苷類似物，但使用干擾素副作用較大，而核苷類似物停藥后容易復發(fā)，且易發(fā)生耐藥。繼續(xù)研制和開發(fā)高效低毒的抗乙型肝炎病毒藥物仍然是當務之急。
　　磷脂爬行酶1(phospholipid scramblase1，PLSCRl）屬于鈣離子結(jié)合的、棕櫚酰化的II型膜蛋白。研究顯示，非棕櫚?；腜LSCR1也能進入細胞核內(nèi)并與基因組DNA結(jié)合。同時PLSCR1也是干擾素刺激基因，干擾素可以通過蛋白激酶C依次激活JNK和STAT1信號通

3、路，繼而調(diào)控PLSCR1的表達。據(jù)文獻報道，通過PLSCR1特異性小干擾抑制PLSCRl表達后，IFN抑制水泡性口炎病毒和腦心肌炎病毒的活性明顯下降，所以上調(diào)PLSCRl表達有可能通過增加抗病毒基因的表達來增強IFN的抗病毒活性。我們前期通過免疫共沉淀等實驗發(fā)現(xiàn)，PLSCR1與 HBV表面蛋白 PreS1結(jié)構(gòu)域有相互作用，進一步研究表明在體內(nèi)外高表達PLSCR1均可以顯著抑制HBV復制，但是其作用機制尚不明確，基于這些研究結(jié)果，本課題繼

4、續(xù)研究PLSCR1與HBV復制的關系，為進一步研究HBV與宿主相互作用奠定基礎，為臨床HBV治療提供新的思路。
　　目的：探討人磷脂爬行酶1抑制 HBV復制的分子機制。
　　方法：將PLSCR1質(zhì)粒與HBV1.3質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，提取細胞內(nèi)和培養(yǎng)基中HBV-DNA，通過熒光定量PCR檢測PLSCR1與HBV1.3質(zhì)粒不同比例轉(zhuǎn)染后對HBV復制的抑制情況；設計合成PLSCR1特異性siRNA，通過半定量PCR和We

5、stern blot等方法驗證siRNA對PLSCR1在mRNA水平和蛋白水平的抑制作用；將經(jīng)過干擾素處理的HepG2細胞轉(zhuǎn)染HBV1.3質(zhì)粒和PLSCR1特異性siRNA，提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后通過半定量PCR檢測細胞中PLSCR1 mRNA表達水平變化，通過ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中HbsAg、HbeAg表達量的變化；在HepG2細胞中分別轉(zhuǎn)染PLSCR1質(zhì)粒、PLSCR1 siRNA、HBV1.3質(zhì)粒48h后采用CCK-8檢測

6、各組細胞增殖變化情況，通過流式細胞儀檢測各組細胞周期變化情況；將帶有熒光素酶報告基因和HBV啟動子基因的質(zhì)粒與PLSCR1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HepG2細胞和Huh7細胞，48h后收取細胞上清，檢測Gluc的活性，研究PLSCR1對HBV啟動子的影響；將 HepG2細胞分為空白對照組、PCMV-HA組、HBV1.3組與HBV1.3+PLSCR1組、PLSCR1組，各組轉(zhuǎn)染對應的質(zhì)粒，48h提取細胞總RNA，通過半定量PCR檢測與HBV感染相關的

7、多個基因的mRNA表達水平的變化；將HepG2細胞分為空白對照組、PCMV-HA組、HBV1.3組與HBV1.3+PLSCR1組、PLSCR1組，各組轉(zhuǎn)染對應的質(zhì)粒，48h提取細胞總蛋白，通過Western blot檢測Toll樣受體及其信號通路相關蛋白的表達變化情況。
　　結(jié)果：在 HepG2內(nèi)高表達PLSCR1可以抑制HBV的復制；經(jīng)過IFN處理的HBV陽性細胞，采用PLSCR1的siRNA抑制PLSCR1的表達，降低了IFN

8、抑制HBV的作用，而且對細胞功能無顯著影響；通過基因重組技術構(gòu)建的含有 HBV啟動子基因的螢光素酶報告基因表達載體與PLSCR1共同轉(zhuǎn)染HepG2細胞結(jié)果顯示PLSCR1可以抑制HBV啟動子的表達，HepG2細胞中，PLSCR1可以逆轉(zhuǎn)多個HBV復制引起的細胞因子的變化；HBV1.3轉(zhuǎn)染HpeG2細胞后抑制了TLR9蛋白的表達，PLSCR1質(zhì)粒與HBV1.3質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染后 TLR9蛋白表達量恢復正常。
　　結(jié)論：PLSCR1在He