芪蛭皺肺顆粒調(diào)控肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞NF-_B信號通路的研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種破壞性的肺部疾病，以不完全可逆性的氣流受限為特征，通常呈進行性發(fā)展，多于有害氣體或顆粒導(dǎo)致的肺部異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。COPD雖然可以進行預(yù)防與治療，但仍具有高發(fā)病、高致殘、高致死率等特點。研究發(fā)現(xiàn)，氣道和肺實質(zhì)的慢性炎癥是COPD發(fā)病的重要機制。有多種炎癥介質(zhì)參與C0PD的發(fā)生發(fā)展過程，并能引起小氣道纖維化及肺結(jié)構(gòu)的破壞，病灶處釋

2、放的炎性介質(zhì)，既會加重肺局部炎癥反應(yīng)，同時也可激活外周血中的炎癥細(xì)胞，引起全身性的炎癥反應(yīng)。目前的研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)是改善COPD癥狀、延緩疾病進程的重要途徑，而控制炎癥介質(zhì)的釋放可能是治療COPD有效性的體現(xiàn)以及抗炎治療的作用點。COPD的炎癥反應(yīng)涉及多種細(xì)胞，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar typeⅡ epithelial ce ll， AT-Ⅱ）是最重要的肺上皮細(xì)胞之一，其具有很高的分化潛能，不僅能自我增值，還能轉(zhuǎn)分化為肺

3、泡Ⅰ型上皮細(xì)胞，并參與機體的免疫防御，具有調(diào)節(jié)肺水轉(zhuǎn)運以及分泌肺表面活性蛋白等功能，在COPD的研究中備受重視。核因子-κB（NF-κB）信號通路廣泛存在于機體各類組織中，I L-6、IL-12等多種炎癥介質(zhì)的表達受其調(diào)控，其不僅參與機體的炎癥反應(yīng)，還與細(xì)胞增殖、抗凋亡等生理效應(yīng)密切相關(guān)。研究認(rèn)為，調(diào)控NF-κB信號通路是抑制肺部炎癥反應(yīng)以及治療COPD的重要途徑之一。本實驗就芪蛭皺肺顆粒對AT-Ⅱ細(xì)胞NF-κB信號通路的調(diào)控作用進行觀

4、察，探討NF-κB信號通路在芪蛭皺肺顆粒控制 COPD炎癥反應(yīng)中所起的作用，為探明芪蛭皺肺顆粒防治 COPD的作用機制提供實驗依據(jù)。
　　目的：
　　觀察芪蛭皺肺顆粒對 AT-Ⅱ細(xì)胞中 NF-κB信號通路的調(diào)控及對炎性介質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，為探明芪蛭皺肺顆粒對COPD炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　參照前期實驗中的細(xì)胞培養(yǎng)方法進行AT-Ⅱ細(xì)胞原代培養(yǎng)，用電鏡及SP-B免疫組化染色鑒定AT-Ⅱ細(xì)

5、胞；選取5瓶生長狀態(tài)良好的 AT-Ⅱ細(xì)胞，分為空白組、模型組、芪蛭皺肺顆粒低、中、高劑量組?？瞻捉M細(xì)胞正常條件培養(yǎng)，其余各組細(xì)胞均以20μ g/ml LPS進行干預(yù)，芪蛭皺肺顆粒給藥組在LPS干預(yù)2 h后，分別給予不同濃度的芪蛭皺肺顆粒，給藥濃度依次為50μ g/ml、100μ g/ml、200μ g/ml，各組細(xì)胞均在培養(yǎng)36-48h后收集，進行相關(guān)檢測。
　　（1）倒置顯微鏡觀察細(xì)胞一般生長狀態(tài)，MTT檢測細(xì)胞活力；電鏡及免疫

6、組化SP-B染色鑒定AT-Ⅱ細(xì)胞。
　　（2）Q-PCR檢測CD14、TLR-4、NF-?B、IL-6、IL-12基因轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：
　?。?）MTT結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的AT-Ⅱ細(xì)胞在培養(yǎng)前10天內(nèi)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，在0～72 h細(xì)胞增殖最為活躍；電鏡下觀察到， AT-Ⅱ細(xì)胞中存在大量深色顆粒，此為AT-Ⅱ細(xì)胞特征性結(jié)構(gòu)（板層小體）；原代培養(yǎng)的AT-Ⅱ細(xì)胞采用SP-B免疫組化染色后，經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)視野中無未

7、著色細(xì)胞，（以細(xì)胞內(nèi)著染棕黃色為陽性結(jié)果），表明以此方法培養(yǎng)的AT-Ⅱ細(xì)胞純度高。
　?。?）Q-PCR結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組CD14、TLR4、NF-κB、IL-6、IL-12基因轉(zhuǎn)錄明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，芪蛭皺肺顆粒干預(yù)組CD14、TLR4、NF-?B、IL-6、IL-12基因轉(zhuǎn)錄水平有不同程度降低，芪蛭皺肺顆粒高劑量組IL-6、IL-12基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜

8、0.01)。
　　結(jié)論：
　?。?）本實驗選用的AT-Ⅱ細(xì)胞，產(chǎn)量好，純度高，能滿足實驗研究需要；
　　（2） LPS可導(dǎo)致AT-Ⅱ細(xì)胞CD14、TLR4、NF-?B及炎癥介質(zhì)IL-6、IL-12基因轉(zhuǎn)錄增加，該作用是由 NF-κB信號通路的調(diào)控機制來實現(xiàn)；芪蛭皺肺顆粒通過調(diào)控NF-κB信號通路中CD14、TLR4、NF-κB及炎癥介質(zhì)IL-6、IL-12的基因轉(zhuǎn)錄水平，抑制AT-Ⅱ細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，該作用可能是芪蛭皺肺