siRNA干擾對高糖及AngⅡ環(huán)境下大鼠腎小管上皮細胞TLR4-Myd88信號通路的影響.pdf

1、目的:通過siRNA(RNAi)干擾技術選擇性下調(diào)TLR4基因的表達,探討高糖對大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)Toll樣受體4(Toll like receptor,TLR4)及其轉(zhuǎn)接子髓分化因子88(myeloid differentiation88, MyD88)和炎性因子分泌的影響。
　　方法:常規(guī)培養(yǎng)細胞后將細胞分3組:1、正常糖組2、高糖組3、AngⅡ組,干預12小時后提取細胞總 RNA及總蛋白,采用熒光定量 PC

2、R檢測 TLR4、MyD88mRNA的表達,western blot檢測TLR4、MyD88及NF-kB蛋白表達水平的變化,分析高糖及AngⅡ?qū)LR4/MyD88信號通路的影響。設計并合成3對針對大鼠TLR4基因的特異性siRNA片段,以帶有紅色熒光的BLOCK-IT Alexa Fluor作為陰性對照,在熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染成功后將細胞分組為1、正常糖組2、高糖+ AngⅡ組3、高糖+ AngⅡ+陰性對照組4、高糖+A

3、ngⅡ+siRNA1組5、高糖+AngⅡ+siRNA2組6、高糖+AngⅡ+siRNA3組,用PCR檢測TLR4mRNA的表達變化,挑選基因沉默效率最佳的siRNA用于進一步實驗,將細胞分組:1、正常糖組2、高糖+AngⅡ組3、高糖+AngⅡ+陰性對照組4、高糖+AngⅡ+siRNA組5、高糖+AngⅡ+厄貝沙坦組6、高糖+AngⅡ+厄貝沙坦+siRNA組,采用熒光定量 PCR檢測 TLR4、MyD88mRNA的表達, western

4、blot檢測TLR4、MyD88及NF-kB蛋白表達水平的變化,同時收集細胞上清液用ELISA法檢測IL-6、及MCP-1的表達。
　　結(jié)果:高糖及 AngⅡ都可以上調(diào) TLR4、MyD88mRNA及 TLR4、MyD88及NF-kB蛋白的表達水平(P<0.01)。siRNA技術可選擇性下調(diào)TLR4mRNA的表達,以 siRNA3基因沉默效果最佳,與正常組相比,高糖+AngⅡ組 TLR4、MyD88及NF-kB蛋白及TLR4、My

5、D88mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.01),IL-6、及MCP-1的表達亦上調(diào)(P<0.01),陰性對照組與高糖+AngⅡ組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),siRNA組及厄貝沙坦組TLR4、MyD88及NF-kB蛋白表達明顯下調(diào),TLR4、MyD88mRNA明顯下調(diào),IL-6、及MCP-1的表達亦下調(diào),且兩者共同作用下效果增強(P<0.01)。
　　結(jié)論:高糖及AngⅡ刺激下可激活TLR4/MyD88信號通路,上調(diào)TLR4及下游