利用體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化外周血單個(gè)核細(xì)胞獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞構(gòu)建組織工程化的毛細(xì)血管網(wǎng).pdf

1、目的：探討體外培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞，從而獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法及鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法。分析不同培養(yǎng)條件對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖分化的影響；探討構(gòu)建三維組織工程化毛細(xì)血管網(wǎng)的方法，分析不同的種子細(xì)胞接種方法對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞在細(xì)胞支架上生長(zhǎng)情況的影響。 方法：細(xì)胞培養(yǎng)：抽取健康志愿者外周靜脈血15ml樣本24份，分為3組，其中實(shí)驗(yàn)組14份，對(duì)照1、2組各5份。用梯度密度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組將獲得的單個(gè)核細(xì)胞接種到表面包被有人纖維粘連蛋白的

2、培養(yǎng)瓶中，并采用VEGF和bFGF誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、分化；對(duì)照1組不采用生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)；對(duì)照2組將單個(gè)核細(xì)胞接種到無纖維粘連蛋白包被的培養(yǎng)瓶中。原代細(xì)胞培養(yǎng)12天后傳代。觀察各組各代細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。通過細(xì)胞克隆形成計(jì)數(shù)、單克隆細(xì)胞計(jì)數(shù)及MTT比色法等方法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力。對(duì)各組的原代細(xì)胞分別行CD34、CD133、Flk-1免疫組化染色，對(duì)各組的第3代細(xì)胞行CD31染色；對(duì)分離得到的單個(gè)核細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)組的第1、2、3代細(xì)胞行CD

3、34、CD133流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，對(duì)各組的原代及第3代細(xì)胞行CD31流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。對(duì)實(shí)驗(yàn)組第3代的細(xì)胞行DiI-AcLDL攝取實(shí)驗(yàn)及FITC-UEA-1結(jié)合實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞-支架復(fù)合物的構(gòu)建及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：BALB/c裸鼠8只，以種子細(xì)胞接種方法的不同平均分為4組。實(shí)驗(yàn)I組為支架吸收時(shí)間實(shí)驗(yàn)組(空白對(duì)照組)，不接種種子細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)Ⅱ組為種子細(xì)胞全量接種組；實(shí)驗(yàn)Ⅲ組為種子細(xì)胞半量接種組：實(shí)驗(yàn)Ⅳ組為種子細(xì)胞全量多次接種組。使用粒子瀝濾法構(gòu)建HFN包被的

4、PLGA支架。利用實(shí)驗(yàn)Ⅰ組的裸鼠動(dòng)物模型檢測(cè)支架吸收時(shí)間。將體外培養(yǎng)獲得實(shí)驗(yàn)組第3代細(xì)胞接種到支架后，繼續(xù)體外培養(yǎng)4周。掃描電鏡檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)情況。將實(shí)驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組得到的細(xì)胞-支架復(fù)合物植入裸鼠背部皮下，待支架完全吸收后，切取裸鼠術(shù)區(qū)皮膚及包含細(xì)胞-支架復(fù)合物的皮下組織，行HE、CD31免疫組化染色和掃描電鏡檢測(cè)，并對(duì)切片行存在內(nèi)皮細(xì)胞的孔隙計(jì)數(shù)及內(nèi)膜完整并內(nèi)有紅細(xì)胞存在的孔隙計(jì)數(shù)。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)獲得的內(nèi)皮祖細(xì)

5、胞增殖分化能力明顯強(qiáng)于對(duì)照1、2組。實(shí)驗(yàn)組第3代細(xì)胞中表達(dá)CD34+CD133+的的細(xì)胞較新分離的單個(gè)核細(xì)胞增加了79倍。實(shí)驗(yàn)組第3代細(xì)胞具有正常內(nèi)皮系細(xì)胞的攝取DiI-acLDL，并結(jié)合FITC-UEA-1的生理功能。纖維粘連蛋白包被的PLGA支架在植入裸鼠皮下11周后被完全吸收。實(shí)驗(yàn)組第3代內(nèi)皮祖細(xì)胞可以吸附并生長(zhǎng)在生物可降解支架上。取材組織鑒定證明在細(xì)胞支架上可見存在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的孔隙及內(nèi)膜完整且內(nèi)有紅細(xì)胞存在的孔隙。這兩種有效孔

6、隙在實(shí)驗(yàn)IV組的細(xì)胞．支架復(fù)合物上形成最多。 結(jié)論：體外培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞可以獲得具有增殖和分化為內(nèi)皮細(xì)胞能力的內(nèi)皮祖細(xì)胞，其數(shù)量和質(zhì)量均能滿足作為構(gòu)建組織工程化毛細(xì)血管網(wǎng)種子細(xì)胞的要求。內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖速度及增殖能力和細(xì)胞克隆形成能力與是否包被纖維粘連蛋白和生長(zhǎng)因子的存在與否均相關(guān)。是否包被纖維粘連蛋白與內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化無關(guān)，生長(zhǎng)因子的存在使實(shí)驗(yàn)組大量的內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化；纖維粘連蛋白包被的PLGA支架的微結(jié)構(gòu)、理