3D打印骨科內(nèi)植物在兔膝關(guān)節(jié)損傷修復(fù)中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:膝關(guān)節(jié)在運(yùn)動(dòng)或高速撞擊中易受到損傷，尤其以韌帶損傷、軟骨損傷及關(guān)節(jié)周?chē)钦圩顬槌Ｒ?jiàn)。若不開(kāi)展有效治療，嚴(yán)重者將導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎、骨折畸形愈合及不愈合等并發(fā)癥。膝關(guān)節(jié)損傷的手術(shù)修復(fù)治療中，相關(guān)骨科內(nèi)植物的應(yīng)用對(duì)修復(fù)的效果至關(guān)重要。以前交叉韌帶(Anterior cruciate ligament，ACL)撕裂為例，在重建ACL過(guò)程中，需采用界面螺釘植入骨隧道內(nèi)對(duì)移植物進(jìn)行固定，以保證移植物的穩(wěn)定性，促進(jìn)腱骨愈合，重塑ACL功能。術(shù)中

2、常用的界面螺釘材料多為生物可吸收性高分子聚合物如聚乳酸(Polylactic acid, PLA)或聯(lián)合無(wú)機(jī)材料如羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)等。相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)部分病例中PLA螺釘術(shù)后在骨隧道內(nèi)完全降解需要7至10年的時(shí)間。較低的降解速率使界面螺釘在骨隧道內(nèi)占位，影響隧道內(nèi)新生骨形成從而阻礙了腱骨愈合效果。而對(duì)于膝關(guān)節(jié)周?chē)钦塾绕涫枪晒沁h(yuǎn)端粉碎性骨折及脛骨平臺(tái)骨折，多需要植入骨移植物進(jìn)行修復(fù)以進(jìn)行骨缺損治療，防治骨

3、折畸形愈合或者骨不連。然而自體骨或異體骨移植以及人工合成的骨移植物因其各自并發(fā)癥限制其在臨床上廣泛應(yīng)用。可見(jiàn)膝關(guān)節(jié)損傷修復(fù)的內(nèi)植物仍存在諸多缺陷，亟待改進(jìn)。
　　近年來(lái)，三維打印（three-dimensional printing，3D printing）技術(shù)在醫(yī)療領(lǐng)域蓬勃發(fā)展，主要是取決于其個(gè)性化定制、可操作性、可實(shí)現(xiàn)多種材料制造等諸多優(yōu)點(diǎn)。在外科手術(shù)中，3D打印技術(shù)目前主要以模型術(shù)前規(guī)劃，導(dǎo)板術(shù)中定位，假體術(shù)中植入的應(yīng)用最為

4、廣泛。因此針對(duì)上述膝關(guān)節(jié)損傷修復(fù)中如ACL重建界面螺釘及膝關(guān)節(jié)周?chē)钦酃且浦参锏牟蛔悖菊n題組希望通過(guò)能借助3D打印技術(shù)，尤其是最近廣泛普及的桌面3D打印機(jī)，利用其成本低，易操作，應(yīng)用材料廣泛的特點(diǎn)來(lái)對(duì)以上兩種損傷修復(fù)的內(nèi)植物進(jìn)行改進(jìn)，使其表現(xiàn)出更好的修復(fù)性能。在運(yùn)用臨床上常規(guī)材料PLA及HA根據(jù)ACL重建模型制造多孔的界面螺釘支架聯(lián)合負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs

5、)用于ACL重建修復(fù)的同時(shí)著眼于新型打印材料用于打印骨移植物支架的強(qiáng)度改進(jìn)，使其可用于關(guān)節(jié)周?chē)钦廴睋p填充修復(fù)，主要內(nèi)容圍繞下述幾個(gè)方面展開(kāi):
　　1、3D打印PLA界面螺釘支架制造及體外生物學(xué)特性;
　　2、PLA/HA界面螺釘支架復(fù)合BMSCs重建兔ACL;
　　3、高強(qiáng)度3D打印摻鎂硅酸鈣支架的制備及理化特性;
　　4、高強(qiáng)度3D打印摻鎂硅酸鈣支架修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)周?chē)侨睋p。
　　第一部分、3D打印PLA

6、界面螺釘支架制造及體外生物學(xué)特性
　　目的：通過(guò)3D打印機(jī)設(shè)計(jì)制備PLA界面螺釘支架，HA對(duì)其進(jìn)行表面修飾，并檢測(cè)螺釘支架負(fù)載細(xì)胞的生物學(xué)性能。
　　方法：依據(jù)新西蘭大白兔前交叉韌帶重建模型設(shè)計(jì)PLA界面螺釘支架并通過(guò)3D打印機(jī)進(jìn)行制造。利用化學(xué)共沉淀方法合成HA粉體，X射線衍射(XRD)鑒定材料成分。通過(guò)層層靜電組裝法對(duì)PLA界面螺釘支架進(jìn)行表面修飾制得PLA/HA螺釘支架，運(yùn)用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察修飾前后支架的表

7、面形態(tài)，通過(guò)排水法測(cè)定螺釘支架的孔隙率。將兔BMSCs分別與PLA，PLA/HA螺釘支架共培養(yǎng)(PLA組，PLA/HA組)，同時(shí)用Pluronic F-127凝膠負(fù)載BMSCs后與PLA-HA支架共培養(yǎng)(PLA/HLA+PluronicF-127組)。通過(guò)SEM觀察三組細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)測(cè)定三組細(xì)胞增殖情況，PCR檢測(cè)三組成骨指標(biāo)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：通過(guò)3D打印機(jī)制備PLA界面螺釘支架符合設(shè)計(jì)要求，支架

8、內(nèi)空道均勻分布，相互連通的，孔徑約為290±16μm，孔隙率為42±5％。合成HA晶體的直徑約200nm。經(jīng)表面修飾后HA在PLA/HA螺釘支架中均勻分布。相較于PLA組和PLA/HA組，PLA/HA+PluronicF-127組表現(xiàn)出良好的細(xì)胞形態(tài)，最高的增殖性能及最佳的成骨分化性能。
　　結(jié)論：通過(guò)3D打印及表面修飾成功制備PLA/HA界面螺釘支架。利用Pluronic F-127凝膠負(fù)載細(xì)胞構(gòu)建PLA/HA螺釘支架BMSCs

9、復(fù)合體，生物活性良好。為在ACL重建中，利用PLA/HA螺釘支架BMSCs復(fù)合體進(jìn)行ACL修復(fù)提供了可能。
　　第二部分、PLA/HA界面螺釘支架復(fù)合BMSCs重建兔ACL
　　目的：將Pluronic F-127凝膠負(fù)載BMSCs種植于PLA/HA螺釘支架上，觀察其用于兔ACL重建自體肌腱移固定后骨隧道骨量變化及腱骨界面愈合情況。
　　方法：將36只新西蘭雄性大白兔隨機(jī)平均分為三組，利用自體肌腱進(jìn)行雙側(cè)ACL重建，股

10、骨側(cè)隧道中置入螺釘支架固定肌腱:PLA組，以單純PLA螺釕支架進(jìn)行固定;PLA/HA組，以單純PLA/HA螺釘支架進(jìn)行固定;BMSCs組，PluronicF-127凝膠負(fù)載BMSCs種植于PLA/HA螺釘支架后進(jìn)行固定。術(shù)后4周，12周分別行MRI掃描，觀察骨隧道內(nèi)螺釘支架的情況;行Micro-CT掃描，分別測(cè)量各組股骨骨隧道的成骨情況;硬組織切片進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，觀察各組股骨骨隧道內(nèi)腱骨愈合情況。
　　結(jié)果：MRI顯示各組螺釘支架

11、沿軸向位于股骨隧道中，無(wú)斷釘及其他并發(fā)癥出現(xiàn)。術(shù)后4周、12周，BMSCs組股骨隧道內(nèi)感興趣區(qū)骨形成指標(biāo)(BV/TV，Tb.N，Tb.Th，Tb.Sp)均高于PLA及PLA/HA組，新生骨沿螺釘孔道在骨隧道內(nèi)均勻分布。尤其是在術(shù)后12周，BMSCs組新生骨相互連接形成一個(gè)類(lèi)似螺釘支架的三維立體結(jié)構(gòu)。硬組織切片組織學(xué)顯示，相較于PLA及PLA/HA組，BMSCs組術(shù)后4周腱骨界面內(nèi)呈現(xiàn)出較多的軟骨樣細(xì)胞表現(xiàn)，術(shù)后12周腱骨整合良好，有更好

12、的細(xì)胞形態(tài)排列及細(xì)胞外基質(zhì)沉積。
　　結(jié)論：PLA/HA界面螺釘支架復(fù)合BMSCs用于兔ACL重建不僅起到自體肌腱固定作用，同時(shí)可對(duì)ACL重建進(jìn)行修復(fù)，有效增加骨隧道內(nèi)新生骨量，形成穩(wěn)定的腱骨愈合界面。
　　第三部分、高強(qiáng)度3D打印摻鎂硅酸鈣支架的制備及理化特性
　　目的：合成摻鎂硅酸鈣粉體(CSi-Mg)，并運(yùn)用3D打印機(jī)制備全新高強(qiáng)度摻鎂硅酸鈣多孔支架，并對(duì)該支架的微觀結(jié)構(gòu)，力學(xué)性能，體外生物降解性等進(jìn)行探究。

13、r>　　方法：化學(xué)沉淀法制備含鎂摩爾比例為10％的摻鎂硅酸鈣粉(CSi-Mg10)，同時(shí)制備純硅酸鈣粉(CSi)及β-磷酸三鈣粉(β-TCP)作為對(duì)照。運(yùn)用XRD檢測(cè)材料成分。稱(chēng)取上述三種材料各5.0g分別與4.0g6％聚乙烯醇溶液均勻混合后制成三種生物陶瓷墨水，進(jìn)行擠出式3D打印，制得三種支架((Φ)6×6mm)。60℃干燥過(guò)夜后1100℃一步燒結(jié)3小時(shí)。排水法計(jì)算支架孔隙率，SEM檢測(cè)支架微觀結(jié)構(gòu)。將支架置于模擬體液SBF中，于相應(yīng)

14、時(shí)間點(diǎn)測(cè)定三種支架的抗壓強(qiáng)度，彈性模量。將支架置于Tris-Hcl緩沖液中，通過(guò)檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)支架重量的損失及溶液中pH值，Ca，Si，Mg的濃度，評(píng)估材料降解過(guò)程中周?chē)h(huán)境的變化。
　　結(jié)果：三種生物陶瓷支架孔徑均約為350μm，孔道相互連接，孔隙率均超過(guò)50％。CSi-Mg10支架初始抗壓強(qiáng)度顯著(～115MPa)，分別超過(guò)CSi的4倍(～26MPa)，TCP的10倍(～11MPa)。18周后，CSi-Mg10支架(～36MPa

15、)相較于另外兩種(＜9MPa)依然保持較高的抗壓強(qiáng)度。此外，相較于CSi過(guò)快降解的劣勢(shì)，CSi-Mg10支架體外降解速率相對(duì)偏慢，隨時(shí)間推移逐漸適量釋放出Ca，Si及Mg成骨活性成分。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)3D打印成功制備全新高強(qiáng)度摻鎂硅酸鈣多孔支架，表現(xiàn)出更佳的體外力學(xué)強(qiáng)度變化及生物降解特性，為骨缺損修復(fù)尤其是負(fù)重區(qū)骨修復(fù)材料領(lǐng)域提供了一個(gè)新方向。
　　第四部分、高強(qiáng)度3D打印摻鎂硅酸鈣支架修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)周?chē)侨睋p
　

16、　目的：利用3D打印摻鎂硅酸鈣多孔支架與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)，探究支架對(duì)體外細(xì)胞增殖和成骨分化的作用。通過(guò)股骨髁缺損模型植入支架進(jìn)行兔膝關(guān)節(jié)周?chē)侨睋p修復(fù)，探究支架的成骨能力，降解特性及體內(nèi)力學(xué)變化。
　　方法：將MC3T3細(xì)胞系分別與3D打印β-TCP，CSi和CSi-Mg10多孔支架共培養(yǎng)后使用SEM及細(xì)胞骨架染色觀察細(xì)胞形態(tài);使用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖性能及PCR評(píng)估支架的成骨性能。在兔膝關(guān)節(jié)周?chē)侨睋p修復(fù)中，36只大白兔隨機(jī)平均

17、分為三組(β-TCP組，CSi組，CSi-Mg10組)，進(jìn)行雙側(cè)股骨髁骨缺損修復(fù)。術(shù)后6周，12周，18周分別行行Micro-CT掃描，分析支架成骨能力;行硬組織切片進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，熒光雙標(biāo)計(jì)算鈣沉積速度(MAP)，觀察新生骨，支架降解情況;使用能譜掃描(EDS)檢測(cè)磷灰石相的轉(zhuǎn)化過(guò)程;于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定體內(nèi)支架的抗壓強(qiáng)度。
　　結(jié)果：體外生物學(xué)檢測(cè)中，CSi-Mg10組相較于CSi組細(xì)胞形態(tài)及成骨能力均無(wú)顯著性差異(p＞0.05）

18、，均顯著高于β-TCP組(p＜0.05)。在膝關(guān)節(jié)周?chē)侨睋p修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，CSi-Mg10組新生骨加速生長(zhǎng)，在術(shù)后18周與CSi組新生骨量無(wú)顯著性差異，同時(shí)仍保持著與缺損區(qū)骨相符的抗壓強(qiáng)度(10-15 MPa)和彈塑性力學(xué)反應(yīng)。然而，β-TCP組成骨顯著遲緩且β-TCP組與CSi組力學(xué)強(qiáng)度較低(＜10MPa)。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功應(yīng)用高強(qiáng)度3D打印摻鎂硅酸鈣多孔支架進(jìn)行兔關(guān)節(jié)周?chē)侨睋p修復(fù)，該支架在有效增加新生骨量的同時(shí)，依然保持