Wnt5a影響U937細(xì)胞中心體分離并抑制細(xì)胞惡性增殖的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 Wnt5a是一種分泌型糖蛋白，在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，若表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致發(fā)育畸形和腫瘤發(fā)生。有研究表明：Wnt5a可以激活不同的信號(hào)通路發(fā)揮不同生理功能，如在腫瘤發(fā)生中既能發(fā)揮促癌因子的作用，也能發(fā)揮抑癌因子的作用。近年來(lái)，國(guó)外和我們的研究發(fā)現(xiàn)：Wnt5a在大多數(shù)白血病細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致了白血病細(xì)胞惡性增殖；我們還在治療緩解的白血病病例中發(fā)現(xiàn)Wnt5a表達(dá)恢復(fù)；在髓系白血病U937細(xì)胞株中，外源性Wnt5

2、a可下調(diào)β-catenin的表達(dá)，并阻滯細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)程，抑制了白血病細(xì)胞的惡性增值，但其機(jī)制尚不明確。本研究以髓系白血病細(xì)胞株U937為模型，采用免疫印跡、免疫沉淀、免疫熒光和RNA干擾等技術(shù)，研究Wnt5a在白血病細(xì)胞中發(fā)揮抑癌因子的作用機(jī)制。深入探討：Wnt5a是否通過(guò)Ror2受體激活JNK/GSK-3β途徑，促進(jìn)β-catenin的磷酸化和降解，并下調(diào)其下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的惡性增殖；Wnt5a是否通過(guò)Ror2/JN

3、K/GSK-3β途徑調(diào)控中心體上β-catenin的表達(dá)和磷酸化，抑制中心體的分離，進(jìn)而阻滯細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)程。該研究有利于從多方面揭示W(wǎng)nt5a在白血病中發(fā)揮抑癌因子的作用機(jī)制，對(duì)深入認(rèn)識(shí)白血病發(fā)病機(jī)理和不斷提高白血病的診療水平均有重要研究?jī)r(jià)值。
　　 方法：
　　 1.Wnt5a對(duì)髓系白血病細(xì)胞中β-catenin表達(dá)和細(xì)胞增殖影響的研究
　　 1.1.用RT-PCR、MSP(甲基化特異性PCR)檢測(cè)髓系白血

4、病骨髓標(biāo)本中Wnt5a表達(dá)及其啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)；分別用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Western blot檢測(cè)病例骨髓細(xì)胞和U937細(xì)胞株中Wnt5a和β-catenin的表達(dá)。
　　 1.2.用Western blot檢測(cè)外源性Wnt5a處理U937細(xì)胞前后，β-catenin及其下游靶基因Cyclin D1、C-myc的表達(dá)情況。
　　 1.3.用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)外源性Wnt5a處理U937細(xì)胞后，β-catenin的

5、轉(zhuǎn)錄活性。
　　 1.4.用MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外源性Wnt5a處理U937細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖活力。
　　 2.U937細(xì)胞中Wnt5a通過(guò)Ror2途徑下調(diào)β-catenin的機(jī)制研究
　　 2.1.免疫組化檢測(cè)急性髓系白血病和健康人骨髓有核細(xì)胞中Ror2和LRP5受體的表達(dá)情況。
　　 2.2.用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)U937細(xì)胞中、Wnt5a、Ror2和LRP5的表達(dá)定位情況，用免疫沉淀法檢測(cè)Wnt5

6、a與Ror2、LRP5受體結(jié)合，用Western blot檢測(cè)Ror2與LRP5受體表達(dá)的情況。
　　 2.3.用Western blot檢測(cè)相應(yīng)抑制因素處理后(如：Ror2Ab、LiC1和SP600125)再以Wnt5a處理的U937細(xì)胞中JNK-p、GSK-3β-p、GSK-3β、β-catenin-p和β-catenin的表達(dá)。
　　 3.Wnt5a/Ror2通過(guò)非經(jīng)典途徑對(duì)中心體分離和細(xì)胞增殖的影響
　　

7、 3.1.用Western blot檢測(cè)各種條件下(如：Ror2Ab和Ad-Si-β-catenin)，Wnt5a處理的U937細(xì)胞中心體上β-catenin的表達(dá)。
　　 3.2.用免疫熒光檢測(cè)中心體上β-catenin的表達(dá)改變對(duì)中心體分離的影響。
　　 3.3.用免疫熒光檢測(cè)中心體上GSK-3β和β-catenin的分布與定位，用免疫沉淀法檢測(cè)中心體上GSK-3β和β-catenin的結(jié)合情況，用Western b

8、lot檢測(cè)在各種條件下(如：Ror2Ab、LiC1和SP600125)Wnt5a處理U937后，細(xì)胞中心體上β-catenin的磷酸化情況。
　　 3.4.用激光共聚焦顯微鏡觀察中心體上β-catenin的磷酸化對(duì)中心體分離的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.髓系白血病病例中，Wnt5a因其啟動(dòng)子甲基化而致表達(dá)下調(diào)，低表達(dá)Win5a的U937細(xì)胞株中β-catenin高表達(dá)。
　　 2.外源性Wnt5a通過(guò)

9、下調(diào)U937細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)，并抑制β-catenin/TCF4的轉(zhuǎn)錄活性，從而下調(diào)其靶基因Cyclin D1、C-myc的表達(dá)。
　　 3.外源性Wnt5a處理U937細(xì)胞后，可阻滯細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)程，抑制細(xì)胞惡性增殖。
　　 4.與健康人相比，急性髓系白血病病例骨髓有核細(xì)胞中Ror2受體表達(dá)較低，而LRP5受體表達(dá)較高。
　　 5.Wnt5a可上調(diào)U937細(xì)胞中Ror2受體的表達(dá)，并與Ror2受

10、體結(jié)合的優(yōu)勢(shì)強(qiáng)于LRP5受體。
　　 6.Wnt5a與Ror2受體結(jié)合后，可激活JNK/GSK-3β非經(jīng)典Wnt信號(hào)，下調(diào)U937細(xì)胞中總β-catenin和中心體上β-catenin表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞中心體上β-catenin的磷酸化，并抑制中心體的分離。
　　 結(jié)論：
　　 在髓系白血病U937細(xì)胞株中，Wnt5a/Ror2/JNK/GSK-3β非經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑通過(guò)影響經(jīng)典Wnt信號(hào)核心分子--β-caten