細(xì)胞凋亡與自體吞噬在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用研究.pdf

1、目的：探討大鼠肝臟缺血再灌注損傷過(guò)程中細(xì)胞凋亡和自體吞噬的作用。
　　 方法：采用雄性SD大鼠,建立大鼠肝臟部分缺血再灌注模型,隨機(jī)分為正常假手術(shù)組(N組;n=10),缺血30分鐘再灌注組(S組;n=40)、缺血60分鐘再灌注組(L組;n=40),后兩組分別于再灌注0點(diǎn)、3小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)設(shè)計(jì)4個(gè)觀察點(diǎn)(A、B、C、D點(diǎn)),每組10只大鼠。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中ALT和AST的活性。肝臟組織HE染色后于×40

2、0倍的光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子TNF、IL-8、IL-2的變化情況。TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡并計(jì)算調(diào)亡指數(shù),鏡下記數(shù)時(shí),每個(gè)標(biāo)本觀察4張切片;每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野,先在低倍顯微鏡下統(tǒng)計(jì)該視野中的細(xì)胞總數(shù)并找出被標(biāo)記的細(xì)胞,然后經(jīng)高倍顯微鏡(×400倍)下計(jì)數(shù)每張切片凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)目及其與總細(xì)胞核數(shù)目比例,取其平均值為細(xì)胞凋亡指數(shù)(APOⅠ)。采用Western-Blot方法對(duì)

3、自體吞噬(簡(jiǎn)稱自噬)進(jìn)行半定量分析,蛋白條帶用Totallab軟件(2.01版)檢測(cè),以IOD值(積分光密度值)代表蛋白表達(dá)的強(qiáng)度,以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白(GADPH)的IOD比值作為目的蛋白表達(dá)水平的參數(shù),用目的蛋白的表達(dá)量來(lái)反映自噬反應(yīng)情況。對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),兩組計(jì)量資料間比較用T檢驗(yàn),三組計(jì)量資料間比較用方差分析,計(jì)數(shù)資料間比較行卡方檢驗(yàn)。P值＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,所有統(tǒng)計(jì)分析均使用正版SPSS11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件完

4、成。
　　 結(jié)果：組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn):在肝臟缺血再灌注損傷過(guò)程中,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),肝組織損傷逐漸加重,再灌注24小時(shí)后達(dá)到高峰,而再灌注48小時(shí)后開(kāi)始出現(xiàn)肝細(xì)胞的增殖修復(fù)。缺血60分鐘手術(shù)組較缺血30分鐘組肝臟損傷普遍嚴(yán)重。電鏡下觀察發(fā)現(xiàn):在肝臟缺血再灌注損傷過(guò)程中,有明顯的細(xì)胞凋亡和自噬現(xiàn)象。在缺血再灌注3小時(shí)后,即可觀察到細(xì)胞凋亡,并隨時(shí)間推移而逐步增加。自噬現(xiàn)象出現(xiàn)較細(xì)胞凋亡為早,缺血30分鐘手術(shù)組和缺血60分鐘手術(shù)組存在

5、明顯差異,其中缺血30分鐘手術(shù)組自噬更為活躍,再灌注3小時(shí)后自噬最明顯,而再灌注24小時(shí)后自噬則明顯減少,但再灌注48小時(shí)后又可以觀察到自噬情況有所恢復(fù)。肝缺血再灌注發(fā)生后兩組ALT、AST、TNF、IL-8、IL-2檢測(cè)結(jié)果皆升高,并隨時(shí)間推移而進(jìn)一步增高,缺血30分鐘手術(shù)組ALT、AST結(jié)果峰值出現(xiàn)于術(shù)后3小時(shí),而后ALT、AST檢測(cè)結(jié)果呈逐步減低,缺血60分鐘手術(shù)組ALT、AST峰值出現(xiàn)于術(shù)后24小時(shí),而在術(shù)后48小時(shí)兩組ALT、

6、AST檢測(cè)結(jié)果皆較前有明顯減低。兩組TNF、IL-8、IL-2監(jiān)測(cè)結(jié)果峰值皆出現(xiàn)于缺血發(fā)生后3小時(shí),隨后TNF、IL-8、IL-2檢測(cè)結(jié)果逐步減低。缺血30分鐘組、缺血60分鐘組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)凋亡指數(shù)均較對(duì)照組增高,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。缺血30分鐘組、缺血60分鐘組術(shù)后凋亡指數(shù)隨時(shí)間變化而增高,其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),同一時(shí)間點(diǎn)缺血30分鐘組凋亡指數(shù)均較缺血60分鐘組凋亡指數(shù)減低,其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、(p＜0.01)。缺血30、60分鐘手術(shù)組不同時(shí)間點(diǎn)凋亡指數(shù)與相同時(shí)間點(diǎn)ALT、AST、IL-8、TNF及IL-2檢測(cè)結(jié)果均無(wú)明顯相關(guān)性(p＞0.05)。缺血30分鐘組、缺血60分鐘組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)LC3檢測(cè)均較對(duì)照組增高,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。缺血30分鐘組、缺血60分鐘組術(shù)后LC3隨時(shí)間變化而增高,其峰值均出現(xiàn)于術(shù)后3小時(shí),而后均隨時(shí)間推移而明顯減低,其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01),同一時(shí)間點(diǎn)缺血30分鐘組L

8、C3均較缺血60分鐘組LC3升高,其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。缺血再灌注30分鐘組LC3隨時(shí)間變化與ALT、AST、IL-2相關(guān)性檢測(cè)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,相關(guān)系數(shù)分別為0.6732(p＜0.01);0.5715(p＜0.05);0.7548(p＜0.01)。缺血再灌注60分鐘組LC3隨時(shí)間變化與AST、IL-8、IL-2相關(guān)性檢測(cè)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,相關(guān)系數(shù)分別為0.5050(p＜0.05);0.7542(p＜0.01);0