兔巴氏桿菌外膜蛋白A基因的克隆、表達(dá)和快速診斷方法的建立.pdf

1、兔巴氏桿菌病(Rabbit Pasteureliosis)是一種由多殺性巴氏桿菌引起的呼吸道傳染病。不同年齡兔均可發(fā)病,發(fā)病率和病死率都很高,嚴(yán)重影響?zhàn)B兔業(yè)的發(fā)展。本研究建立了兔巴氏桿菌的PCR及抗體的ELISA檢測(cè)方法,可用于該病的臨床快速診斷及血清學(xué)監(jiān)測(cè)。
　　 以兔多殺性巴氏桿菌的高度保守的16S rRNA為靶基因,參考已公布的多殺性巴氏桿菌的16S rRNA基因設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物,優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,建立了兔多殺性巴氏桿

2、菌PCR快速檢測(cè)方法。該P(yáng)CR方法的敏感性達(dá)到60cfu/mL,使用建立的PCR方法擴(kuò)增兔多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和分離株均能擴(kuò)增出的643bp的目的片段,擴(kuò)增兔大腸桿菌、支氣管敗血波氏桿菌結(jié)果為陰性,證明本試驗(yàn)所建立的兔多殺性巴氏桿菌病原PCR檢測(cè)方法敏感、特異、可靠。
　　 根據(jù)多殺性巴氏桿菌外膜蛋白A(OmpA)基因序列,設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物,將PCR擴(kuò)增的基因片段定向插入原核表達(dá)載體pET28a(+)中,構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pE

3、T-OmpA,轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21(DE3),并對(duì)重組蛋白表達(dá)條件、純化條件進(jìn)行優(yōu)化；Western blot分析表明OmpA重組蛋白具有免疫原性,能被兔多殺性巴氏桿菌陽性血清識(shí)別。兔多殺性巴氏桿菌OmpA重組蛋白的成功表達(dá),為開展該基因功能研究和血清學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　 用純化的兔多殺性巴氏桿菌OmpA重組蛋白作為包被抗原,初步建立了檢測(cè)兔多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA方法,優(yōu)化并確定了ELISA最佳工作條件