rAAV6介導miR361-PSR下調心肌細胞PDE9A基因表達的體外研究.pdf

1、目的：構建包含心臟肌鈣蛋白T啟動子（cTnT啟動子）和miR361-PSR(hCGin-miR361-PDE9AshRNA)表達框的重組質粒，包裝6型重組腺相關病毒(rAAV6-cTnT-miR361-PSR)，體外轉導原代心肌細胞，應用RNA干擾原理，下調PDE9A基因的表達，觀察原代心肌細胞中PDE9A基因mRNA和蛋白水平的變化。
　　方法：⑴構建基于miRNA361骨架靶向下調PDE9A表達的shRNA片段（miR361-

2、PSR片段），與質粒pAAV-cTnT-null進行雙酶切(BamHⅠ、NotⅠ)，將得到酶切片段連接構成重組質粒pAAV-cTnT-miR361-PSR。⑵將pAAV-cTnT-miR361-PSR重組質粒、pAAV6包裝質粒及輔助質粒，共轉染293細胞，獲得rAAV6-cTnT-miR361-PSR病毒。用SDS-PAGE測定病毒純度和Dot Blot法測定病毒滴度。⑶重組病毒rAAV6-cTnT-miR361-PSR轉導乳鼠原代心

3、肌細胞，提取mRNA和蛋白質，用RT-PCR和Western Blot法測定PDE9A基因的表達水平的變化。
　　結果：①成功構建pAAV-cTnT-miR361-PSR重組質粒。②成功包裝rAAV6-cTnT-miR361-PSR重組病毒。③rAAV6-cTnT-miR361-PSR重組病毒轉導原代心肌細胞后PDE9A基因的mRNA和蛋白量均明顯低于對照組。
　　結論：成功包裝rAAV6-cTnT-miR361-PSR重組