CCN1基因腺病毒在放創(chuàng)復(fù)合傷修復(fù)中的作用和機理研究.pdf

1、目的: 放創(chuàng)復(fù)合傷是戰(zhàn)時核爆炸和平時核事故中所發(fā)生的主要傷型之一，損傷后其傷口愈合主要表現(xiàn)為愈合延遲，甚至長期不愈合。CCN1(Cysteinerich61，Cyr61/CCN1)是即刻早期基因CCN家族成員，體外研究顯示其能促進細胞黏附、增殖、遷移，調(diào)節(jié)血管生成，影響基質(zhì)代謝，參與創(chuàng)傷修復(fù)，關(guān)于CCN1在放創(chuàng)復(fù)合傷愈合中的作用尚未見報道。本課題檢測CCN1蛋白和mRNA在大鼠放創(chuàng)復(fù)合傷創(chuàng)面肉芽組織的表達情況；構(gòu)建重組腺病毒Ad

2、CCN1感染創(chuàng)面組織后促進創(chuàng)傷愈合以及對創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)因子的表達調(diào)控。通過研究，探討CCN1在放創(chuàng)復(fù)合傷愈合中的作用及機制。為深入認識傷口愈合過程的機制提供新的視角，并為探索促愈治療新藥提供新的途徑。 方法和結(jié)果: 1.放創(chuàng)復(fù)合傷大鼠模型的建立及CCN1在創(chuàng)面組織中的表達和意義：將大鼠隨機分為單純創(chuàng)傷組和放創(chuàng)復(fù)合傷組。放創(chuàng)復(fù)合傷組采用60Coγ射線進行全身照射在照射后1h內(nèi)，制背部皮膚全層切除傷口。在傷后的第0、3、6、9

3、、15、21d取材，用RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色分別檢測CCN1mRNA和蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)在傷后約15d之前CCN1蛋白和mRNA較單純創(chuàng)傷表達下降，約21d時表達量升高。CCN1的表達較單純創(chuàng)傷組延遲。 2.CCN1腺病毒的構(gòu)建、制備及其活性檢測：通過酶切連接的方式將pCMV-CCN1中的小鼠CCN1表達框連入pAdTrace-TO4穿梭載體中獲得pAdTrace-CCN1，線性化后在AdEasy-1大腸桿菌中進行同源

4、重組，獲得pAdCCN1重組腺病毒質(zhì)粒，隨后線性化轉(zhuǎn)染293細胞進行病毒顆粒包裝。收集病毒裂解液并反復(fù)感染293細胞擴增病毒后感染創(chuàng)面CHO細胞和創(chuàng)面組織細胞，用WesternBlot和IHC鑒定CCN1在CHO細胞中正確分泌，并且在創(chuàng)面組織細胞中高表達。 3.CCN1重組腺病毒在放創(chuàng)復(fù)合傷修復(fù)中的作用及其機理的實驗研究：致傷后，立即在創(chuàng)面邊緣分別皮下注射等量AdCCN1病毒和AdRFP病毒，7天后取材固定制作石蠟切片，HE染色

5、表明AdCCN1組創(chuàng)面，成纖維細胞增多，微血管密度增高，IHC檢測MMP1、TIMP1、bFGF等創(chuàng)傷愈合相關(guān)因子表達均升高。 結(jié)論: 1.建立了放創(chuàng)復(fù)合傷大鼠模型，檢測到創(chuàng)面肉芽組織中在傷后約15d之前CCN1蛋白和mRNA較單純創(chuàng)傷表達下降，約21d時表達量升高。CCN1的表達下降可能是放創(chuàng)復(fù)合傷難愈的原因之一。 2.應(yīng)用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建、制備AdCCN1重組腺病毒，酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期相符；發(fā)現(xiàn)其可以感染