基于微小凹圖式上的神經(jīng)細(xì)胞多維培養(yǎng)及功能響應(yīng)性研究.pdf

1、細(xì)胞與基底的相互作用是細(xì)胞生物學(xué)、生物材料學(xué)及組織工程學(xué)等領(lǐng)域共同關(guān)注的研究內(nèi)容，利用微加工技術(shù)探尋及模擬組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞在其特定微環(huán)境中的生長行為及功能響應(yīng)等對(duì)于理解體內(nèi)胚胎發(fā)育、神經(jīng)組織再生及修復(fù)等具有重要的意義。然而生長在低縱深圖式化結(jié)構(gòu)底部上的細(xì)胞同時(shí)受底面及側(cè)壁的影響，這些圖式往往并不支持真正的側(cè)壁上三維培養(yǎng)而應(yīng)被看做近似二維(near two-dimensional,N2D)培養(yǎng)系統(tǒng)，這種在單細(xì)胞(single cell)水平

2、上的近似二維培養(yǎng)與側(cè)壁上的三維培養(yǎng)其細(xì)胞是否具有相同的功能特性仍是一個(gè)待解決的問題。且在以神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)聚集體為基礎(chǔ)的干細(xì)胞組織工程及微系統(tǒng)構(gòu)建中，其在多細(xì)胞水平(multiple cells)上又是如何通過細(xì)胞與基底及細(xì)胞間的相互作用共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)響應(yīng)呢？因此，實(shí)現(xiàn)不同水平上的神經(jīng)細(xì)胞在圖式化結(jié)構(gòu)基底上的多維培養(yǎng)及原位評(píng)價(jià)不同培養(yǎng)系統(tǒng)細(xì)胞的功能響應(yīng)與生長行為之間的關(guān)系是構(gòu)建神經(jīng)細(xì)胞微系統(tǒng)及組織工程植入體的重要環(huán)節(jié)。

3、>　　本文基于微加工技術(shù)設(shè)計(jì)并制備出微小凹直徑分別為80μm，100μm，120μm，微小凹深度為100μm，無通道和通道寬度分別為20μm和40μm的PLLA微小凹圖式結(jié)構(gòu)基底，實(shí)現(xiàn)了SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和海馬NSCs在圖式上的復(fù)合培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化?？疾炝藘煞N水平上的神經(jīng)細(xì)胞定向遷移、轉(zhuǎn)化及其影響因素，進(jìn)而構(gòu)建出神經(jīng)細(xì)胞多維培養(yǎng)模型。此外，結(jié)合免疫熒光染色及鈣離子熒光檢測技術(shù)原位評(píng)價(jià)了該培養(yǎng)模型中細(xì)胞的生長行為及功能響應(yīng)特性

4、，探究了ROCK信號(hào)通路及RGK蛋白Gem在細(xì)胞生物學(xué)響應(yīng)中的調(diào)節(jié)機(jī)制，并構(gòu)建出具有功能性的圖示化神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。本研究可應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞微系統(tǒng)中高通量藥物篩選及靶標(biāo)響應(yīng)性的功能評(píng)價(jià)及組織工程植入體的體外構(gòu)建等。
　　本文的主要內(nèi)容和結(jié)果：
　　(1)設(shè)計(jì)并制備出PLLA微小凹圖示結(jié)構(gòu)基底，進(jìn)而構(gòu)建出由微小凹底部受側(cè)壁限制的近似二維細(xì)胞(N2D cells)、側(cè)壁上的三維細(xì)胞(3D cells)和結(jié)構(gòu)表面的二維細(xì)胞(TS-2D

5、cells)組成的SH-SY5Y細(xì)胞多維培養(yǎng)模型，并評(píng)價(jià)了其在單細(xì)胞水平上的生長行為及鈣離子功能響應(yīng)特性。研究發(fā)現(xiàn)微小凹圖示通過誘導(dǎo)N2D細(xì)胞在圖示上的定向遷移、轉(zhuǎn)化進(jìn)而完成其多維培養(yǎng)模型的構(gòu)建，且伴隨著細(xì)胞微絲骨架的重排及形態(tài)特征的變化。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)圖式上的細(xì)胞(N2D and 3D cells)較平面基底上的細(xì)胞(FS-2D cells)表現(xiàn)出形態(tài)鋪展和VGCCs功能響應(yīng)性的明顯降低，且N2D細(xì)胞的相應(yīng)值均介于FS-2D細(xì)胞和3D

6、細(xì)胞之間，提示細(xì)胞的VGCCs功能響應(yīng)性與其形態(tài)鋪展具有明顯的相關(guān)性。
　　(2)通過引入ROCK信號(hào)通路抑制劑研究了微小凹圖示上SH-SY5Y細(xì)胞生長行為及功能響應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)微小凹圖式通過抑制ROCK信號(hào)通路的活性，進(jìn)而抑制SH-SY5Y細(xì)胞在圖式上的微絲骨架排布、形態(tài)鋪展及黏著斑的裝配；而抑制ROCK信號(hào)通路后對(duì)細(xì)胞在圖式上增殖及遷移的影響具有時(shí)間依賴性，且圖式結(jié)構(gòu)基底本身的微環(huán)境因素及細(xì)胞形態(tài)、密度等其他因素對(duì)其的

7、影響更大。此外，抑制ROCK信號(hào)通路后對(duì)鋪展形態(tài)較好的FS-2D及N2D細(xì)胞其VGCCs功能響應(yīng)具有抑制作用，而對(duì)側(cè)壁上呈球狀的3D細(xì)胞反而具有促進(jìn)作用，這一結(jié)果與其RGK蛋白Gem的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性，表明細(xì)胞的功能響應(yīng)與其培養(yǎng)系統(tǒng)及形態(tài)特征密切相關(guān)。
　　(3)在多細(xì)胞水平上研究了大鼠海馬NSCs在微小凹圖式上的生長行為及其多維培養(yǎng)模型的構(gòu)建，并評(píng)價(jià)了圖式上NSCs干細(xì)胞特性的保持。研究發(fā)現(xiàn)微小凹圖示上細(xì)胞與基底及細(xì)胞間的

8、相互作用共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的定向遷移及微小凹內(nèi)聚集體的形成，從而構(gòu)建出微小凹內(nèi)以三維聚集體方式生長(MW-3D cells)和圖式結(jié)構(gòu)表面以二維貼壁方式生長(TS-2D cells)的NSCs多維培養(yǎng)模型，且無通道微小凹圖式早于有通道微小凹圖式完成其多維培養(yǎng)模型的構(gòu)建。而有通道微小凹內(nèi)更利于其干細(xì)胞的長期增殖及干細(xì)胞特性的保持，且可用于構(gòu)建準(zhǔn)一維排布的神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。
　　(4)通過對(duì)圖式上海馬NSCs誘導(dǎo)分化以研究其圖式化神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的