同種異體移植脂肪源干細(xì)胞對運(yùn)動性疲勞大鼠的影響.pdf

1、背景:運(yùn)動性疲勞是指機(jī)體在生理過程中不能維持其機(jī)能在一特定水平上和/或不能維持預(yù)定的運(yùn)動強(qiáng)度,主要表現(xiàn)為運(yùn)動員經(jīng)過一段時(shí)間的大強(qiáng)度訓(xùn)練或激烈的運(yùn)動或比賽之后出現(xiàn)機(jī)體疲勞,無法達(dá)到原有的競技水平。如何延緩運(yùn)動性疲勞的產(chǎn)生和加速其消除是運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。現(xiàn)在大多數(shù)是研究藥物對機(jī)體的影響,以傳統(tǒng)中藥和中藥復(fù)方為多,也有一些合成藥物。研究表明,這些藥物均對機(jī)體運(yùn)動疲勞的延緩或消除有一定影響,但效果不持久。
　　 原林教授提出的筋膜

2、學(xué)認(rèn)為,整個(gè)有機(jī)體可分為支持與儲備系統(tǒng)和功能系統(tǒng)。生物通過支持儲備系統(tǒng)維持較長的生命周期和維持機(jī)體穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。功能系統(tǒng)在支持與儲備系統(tǒng)支持下維持結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定,支持與儲備系統(tǒng)則不斷的為功能系統(tǒng)的細(xì)胞更新和功能活動提供細(xì)胞源泉和細(xì)胞活動所需的營養(yǎng)物質(zhì)。功能系統(tǒng)是以功能細(xì)胞的專能特化為特點(diǎn),而作為支持與儲備系統(tǒng)的筋膜支架是以干細(xì)胞為核心,通過向各種定向干細(xì)胞分化,不斷為功能系統(tǒng)的更新提供細(xì)胞補(bǔ)充,并為功能系統(tǒng)的各種細(xì)胞的更新、代謝提供了

3、一個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。大強(qiáng)度的運(yùn)動,機(jī)體筋膜中的儲備被快速耗竭,機(jī)體的支持儲備系統(tǒng)補(bǔ)充不足,可導(dǎo)致機(jī)體疲勞提前產(chǎn)生,耐力不足。如何保持筋膜的正常狀態(tài),為功能系統(tǒng)提供穩(wěn)定的細(xì)胞來源并維持其向功能細(xì)胞的正常分化,是延緩或消除疲勞的關(guān)鍵。如果過度消耗的干細(xì)胞能得到及時(shí)補(bǔ)充,為機(jī)體提供新的細(xì)胞儲備,不僅可延緩運(yùn)動疲勞的產(chǎn)生和消除疲勞,而且還可以提高運(yùn)動員的運(yùn)動壽命。
　　 脂肪源干細(xì)胞(adipose-derived.stem cells,

4、ADSCs)是指筋膜脂肪組織中具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群,是從筋膜結(jié)締組織中獲取的一類具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。Zuk等首次從人的脂肪組織懸液中分離出了可以在體外穩(wěn)定增殖、具有多向分化能力的脂肪組織提取細(xì)胞(processed lipoaspirate cells,PLA細(xì)胞)。與其它成體干細(xì)胞比較,PLA細(xì)胞具有來源廣泛、取材方便,創(chuàng)傷小且不存在免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)證明ADSCs具有跨胚層的多向分化潛能?？勺鳛楦杉?xì)胞資源通過分化對

5、功能細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)充,也可刺激機(jī)體分泌各種因子,促進(jìn)機(jī)體的損傷修復(fù)。在誘導(dǎo)作用下,它可以分化成中胚層來源的脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞,外胚層來源的神經(jīng)細(xì)胞,也可以分化成內(nèi)胚層來源的內(nèi)皮細(xì)胞,及肝細(xì)胞等。
　　 力竭游泳運(yùn)動訓(xùn)練造成的運(yùn)動疲勞模型是國內(nèi)外比較公認(rèn)的模型。在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)對大鼠進(jìn)行游泳訓(xùn)練,進(jìn)行力竭游泳,使大鼠處于一種運(yùn)動疲勞狀態(tài)。長期運(yùn)動疲勞的大鼠,機(jī)體代謝失衡。反映機(jī)體運(yùn)動能力的一些指標(biāo)發(fā)生顯著變化,如肌

6、糖原、肝糖原含量急劇下降,血液中的血紅蛋白(Hb)含量下降,血清尿素(BUN)、乳酸脫氫酶(LDH)、血乳酸(BLa)等和運(yùn)動能力負(fù)相關(guān)的指標(biāo)顯著升高。反映肝臟狀態(tài)的指標(biāo)如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)活性含量也發(fā)生顯著變化。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過觀察一些與運(yùn)動疲勞相關(guān)的血液生化指標(biāo)的變化,肌糖原、肝糖原含量的變化,反映骨骼肌狀態(tài)的指標(biāo)的變化,骨骼肌的變化,以及力竭游泳時(shí)間的變化,來探

7、討外源性脂肪源干細(xì)胞移植是否具有延緩或消除運(yùn)動疲勞的作用,探索一種新的抗運(yùn)動疲勞機(jī)制,為提高機(jī)體運(yùn)動能力延長運(yùn)動壽命提供新的思路和方法,進(jìn)而為筋膜學(xué)說提供實(shí)驗(yàn)佐證。
　　 目的:通過觀察同種異體移植脂肪源干細(xì)胞對力竭游泳導(dǎo)致大鼠運(yùn)動疲勞相關(guān)血液生化指標(biāo),反映肝臟狀態(tài)的指標(biāo),骨骼肌,以及力竭游泳時(shí)間的變化的影響,來探討外源性脂肪源干細(xì)胞移植是否具有延緩或消除運(yùn)動疲勞的作用,進(jìn)一步為筋膜結(jié)締組織作為機(jī)體的干細(xì)胞儲備源泉提供證據(jù)支持,

8、為筋膜學(xué)提供理論支撐。
　　 1.通過對非特異性筋膜結(jié)締組織分離培養(yǎng),觀察非特異性筋膜結(jié)締組織中是否存在脂肪源干細(xì)胞；
　　 2.觀察移植脂肪源干細(xì)胞對力竭游泳大鼠的血清尿素(BUN)、乳酸脫氫酶(LDH)、血乳酸(BLa)和血紅蛋白(Hb)含量影響,探討其血清學(xué)意義；
　　 3.觀察移植脂肪源干細(xì)胞對力竭游泳大鼠的反映肝臟狀態(tài)的指標(biāo)如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)

9、活性含量以及肝糖原的含量影響。
　　 4.觀察移植脂肪源干細(xì)胞對力竭游泳大鼠的肌糖原、骨骼肌以及力竭游泳時(shí)間的變化的影響。通過免疫組織化學(xué)染色,觀察移植標(biāo)記的脂肪源干細(xì)胞在骨骼肌組織中的定位和移位情況。
　　 方法
　　 1.取3個(gè)月齡Wistar大鼠腹股溝脂肪墊,酶消化法分離、培養(yǎng)脂肪源干細(xì)胞。通過形態(tài)學(xué)、功能學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)鑒定所分離、培養(yǎng)的細(xì)胞是否具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性,來判斷非特異性筋膜結(jié)締組織中是否具有間

10、充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2.40只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分成安靜對照組(A空白對照組)、游泳訓(xùn)練照組(B模型組)、安靜移植細(xì)胞組(C實(shí)驗(yàn)對照組)和游泳移植細(xì)胞組(D實(shí)驗(yàn)組)。模型組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行力竭游泳訓(xùn)練。
　　 3.大鼠適應(yīng)性游泳訓(xùn)練一周后,實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對照組經(jīng)尾靜脈輸入ADSCs。用于移植的第4代ADSCs在進(jìn)行傳代后,在培養(yǎng)基中加入10μmol/L的Brdu,培養(yǎng)3天后消化收集,無菌生理鹽水重懸,200萬/ml。每只

11、大鼠經(jīng)尾靜脈注射ADSCs2×106個(gè),模型組輸入生理鹽水1ml。模型組和實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)完成訓(xùn)練計(jì)劃。
　　 4.游泳訓(xùn)練計(jì)劃結(jié)束后,4組大鼠均于第27d開始進(jìn)行力竭游泳,記錄力竭時(shí)間；然后水合氯醛麻醉大鼠,心臟取血,部分備用檢測Hb,其余室溫下放置8h后3000r/min,離心15min制備血清,檢測BUN、BLa、LDH；取肝臟以及股四頭肌,迅速凍存到-80℃冰箱,以備檢測；取大鼠腓腸肌,多聚甲醛固定,以備組織化學(xué)檢測。

12、　　 結(jié)果
　　 1.脂肪源干細(xì)胞具有長梭形、多角形的形態(tài)學(xué)特征,可以形成細(xì)胞集落。細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測,細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性。體外誘導(dǎo)可以分化成脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞。
　　 2.力竭游泳訓(xùn)練可以導(dǎo)致大鼠運(yùn)動疲勞,模型組與空白對照組比較,肝糖原、肌糖原、Hb水平顯著降低,血清BUN、LDH、BLa水平均顯著升高,肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)水平降低、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)變化不明顯、而丙二醛(M

13、DA)含量升高(P<0.01)。移植ADSCs后,運(yùn)動疲勞大鼠實(shí)驗(yàn)組與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組肝糖原、肌糖原、Hb、SOD、GSH-PX顯著提高(P<0.01),而BUN、LDH、BLa、MDA水平均明顯降低(P<0.01)。
　　 3.經(jīng)過游泳訓(xùn)練后,大鼠的力竭時(shí)間,模型組與空白對照組比較,力竭時(shí)間顯著延長(P<0.01)；與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組力竭時(shí)間有較大提高(P<0.01)。
　　 結(jié)論
　　 1.光學(xué)顯微鏡下觀

14、察:可見細(xì)胞形態(tài)均一,呈多角形或者長梭形。表型鑒定:3代ADSCs流式細(xì)胞儀表面抗原檢測結(jié)果顯示,CD29-APC呈強(qiáng)陽性,陽性率達(dá)到99％以上；CD90-FITC也呈陽性,陽性率可達(dá)到95％；而CD11b/c-APC、CD45-PE、CD106-PE、CD49d-FITC呈陰性,陰性率均達(dá)到90％以上。綜上可以得出在成年大鼠的筋膜結(jié)締組織中存在未分化間充質(zhì)干細(xì)胞的結(jié)論。
　　 2.通過對大鼠的指標(biāo)檢測以及行為觀察,力竭游泳訓(xùn)練

15、導(dǎo)致運(yùn)動疲勞模型成功。
　　 3.靜脈移植脂肪源干細(xì)胞,可以顯著升高運(yùn)動疲勞大鼠血液中Hb的含量,有效降低BUN、LDH、BLa含量。
　　 4.靜脈移植脂肪源干細(xì)胞,可以顯著升高運(yùn)動疲勞大鼠肝臟中肝糖原、SOD、GSH-PX含量,有效降低MDA含量。
　　 5.靜脈移植脂肪源干細(xì)胞,可以有效改善了運(yùn)動疲勞大鼠的力竭游泳時(shí)間。
　　 綜上所述,本研究分別采用了細(xì)胞分離培養(yǎng)、免疫組化學(xué)、行為學(xué)等技術(shù)手段,從