應(yīng)用同種異體脂肪干細胞重建硬膜外脂肪的實驗研究.pdf

1、目的：臨床上行椎間盤切除術(shù)等脊柱手術(shù)的患者,其脊柱硬膜外的脂肪常造成損傷,從而導(dǎo)致術(shù)后脊柱硬膜外纖維化,嚴重影響患者的生存質(zhì)量。本課題應(yīng)用同種異體兔脂肪干細胞(Adipose-Derived Stem Cells，ADSCs),復(fù)合高分子材料聚L-谷氨酸(poly(L-Glutamic Acid)，PLGA)和殼聚糖（chitosan，CS）,經(jīng)體外成脂肪誘導(dǎo),重建手術(shù)損傷的兔脊柱硬膜外脂肪組織。同時,對脂肪干細胞的免疫原性與免疫抑制特

2、性探討。
　　方法：取第3代到第5代兔脂肪干細胞進行實驗（1）取兔腹股溝處的脂肪,平均體積約為5ml,用Ⅰ型膠原酶在體外消化,做兔脂肪干細胞的原代（P0）培養(yǎng),體外培養(yǎng)15天左右至第3代(P3)；在二維培養(yǎng)皿上進行成脂肪誘導(dǎo)7天,油紅染色檢測脂滴,甘油磷酸脫氫酶（3-glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPDH）檢測成脂率,以及成脂的特異性基因：過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome p

3、roliferator-activated receptor，PPARγ）、瘦素（LEPTIN)及脂蛋白脂肪酶（lipoprteinlipase，LPL）的表達檢測（2）未誘導(dǎo)的脂肪干細胞以5×107個/ml的濃度約300ul的體積接種于PLGA&CS復(fù)合材料（2cm×1cm×0.5cm）上,于接種后的第7天進行掃描電鏡觀測細胞外基質(zhì)情況,接種后1,4,7天共聚焦觀察兔脂肪干細胞在材料上粘附生長情況。DNA法檢測兔脂肪干細胞在材料上的增

4、殖曲線。兔脂肪干細胞-材料復(fù)合物體外進行成脂誘導(dǎo)1周，RT-PCR檢測成脂基因PPARγ，LEPTIN，LPL表達。以含有四氧化三鐵（濃度為0.05mg/ml）的普通培養(yǎng)基和兔脂肪干細胞靜置培養(yǎng)48小時,普通光鏡和透射電鏡檢測磁性納米顆粒材料（magnetic nanoparticles，MN)標記的脂肪干細胞,體外消化后進行兔脂肪干細胞材料接種（3）兔脊柱椎板切除術(shù),手術(shù)去除脊柱硬膜外脂肪,將體外成脂誘導(dǎo)7天的兔脂肪干細胞-材料復(fù)合物

5、植入去除脂肪的脊柱硬膜處；同樣的方法植入經(jīng)過消毒處理的單純材料；單純損傷為去除硬膜外脂肪厚不做任何處理,為陰性對照；正常組作為空白對照。于術(shù)后1W,12W,16W進行核磁共振成像,不同時間點矢狀位和橫斷位MRI分組對比觀察修復(fù)情況；取正常兔脊柱,石蠟包埋后進行免疫組化分析,對脊柱的橫斷面進行HE和 masson染色。（4）分離培養(yǎng)C57小鼠的脂肪干細胞,體外成脂誘導(dǎo)三天,將脂肪干細胞和誘導(dǎo)后的脂肪干細胞進行Co60照射,使其失去增殖活性

6、,以105個脂肪干細胞和誘導(dǎo)的脂肪干細胞加入BABL/C小鼠的淋巴細胞共培養(yǎng),以滅活的C57小鼠淋巴細胞作為對照,刺激72小時后CCK-8檢測法觀察淋巴細胞增殖情況；同上面的方法,加入PHA刺激105個BABL/C小鼠的淋巴細胞,105、104、103、102梯度濃度的C57小鼠脂肪干細胞和誘導(dǎo)的脂肪干細胞加入觀察淋巴細胞增殖情況；同理,同為BABL/C小鼠脂肪干細胞處理,等梯度濃度與異體BABL/C共培養(yǎng)，CCK8檢測其細胞增殖活性。

7、
　　結(jié)果：在體外成脂誘導(dǎo)條件下,甘油磷酸脫氫酶GPDH檢測,油紅染色,RT結(jié)果顯示兔脂肪干細胞誘導(dǎo)成脂肪細胞；共聚焦,掃描電鏡,增殖曲線結(jié)果顯示材料和兔脂肪干細胞結(jié)合良好；MRI核磁共振結(jié)果顯示,（1）兔脂肪干細胞-材料組在12W脊柱硬膜外出現(xiàn)點狀的脂肪陰影,16W脊柱硬膜外的點狀脂肪組織影變成連續(xù)的較正常脂肪組織密度稍低的脂肪高亮影,（2）單純材料組沒能重建脊柱硬膜外脂肪,但是研究發(fā)現(xiàn)材料組也能夠在體內(nèi)抑制脊柱硬膜外組織的纖維