第三方骨髓間充值干細(xì)胞對(duì)同種異體皮膚移植的影響.pdf

1、目的：通過建立第三方骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow-derived mesenchymalstem cells，BMSCs）移植免疫排斥的模型，建立BM-MSCs培養(yǎng)的方法，觀察不同處理對(duì)同種異體皮膚移植存活時(shí)間的影響，探討第三方BM-MSCs對(duì)同種異體皮膚移植的影響。
　　 方法：
　　 1、BMSCs的分離、培養(yǎng)和純化將SD大鼠腹腔麻醉，無菌條件下制取股骨骨髓單細(xì)胞懸液，接種于含有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

2、3 d后除去非貼壁細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞鋪滿后進(jìn)行傳代。取3代后的細(xì)胞調(diào)整濃度備用。
　　 2、同種異體皮膚移植的動(dòng)物模型選用Sprague-Dawley（SD）大鼠為第三方骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的供體，雄性BALB/C小鼠50只為皮膚移植的受體，C57BL/6小鼠40只為皮膚移植的供體。應(yīng)用鉗夾法切去全厚皮膚，修剪成皮片，移植于受體創(chuàng)面處，經(jīng)過練習(xí)熟練地操作，保證移植的成功。
　　 3、各組受體小鼠移植皮膚存活

3、時(shí)間、病理變化BALB/C小鼠（受體）隨機(jī)分為5組，每組10只：空白對(duì)照組，即直接進(jìn)行皮膚移植；單純給予受體環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CP組）；單純給予受體SD-BMSCs移植（SD-BMSCs組）；給予受體CP+SD-BMSCs移植（CP+SD-BMSCs組）；CM-DiI熒光標(biāo)記組。前4組給予相應(yīng)干預(yù)后隨即接受C57BL/6小鼠（供體）皮膚移植。術(shù)后觀察小鼠皮膚移植的存活時(shí)間，皮膚的病理變化。
　　 4、外

4、周血中第三方骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的含量及體內(nèi)分布
　　 經(jīng)過分離純化，體外擴(kuò)增獲得第三代BMSCs經(jīng)DiI熒光標(biāo)記。標(biāo)記后的MSCs行尾靜脈注射，觀察染色后的細(xì)胞生長(zhǎng)情況和第7、14、30天小鼠體內(nèi)的紅色熒光細(xì)胞的存在部位。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中DiI熒光標(biāo)記的細(xì)胞的含量。
　　 5、混合淋巴細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)將培養(yǎng)的BMSCs調(diào)節(jié)細(xì)胞的濃度加入96孔培養(yǎng)板中，待貼壁后再加入受體小鼠的脾淋巴懸液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，加入MTT，

5、培養(yǎng)時(shí)間到后上機(jī)檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1、SD-BMSCs體外分離培養(yǎng)倒置相差顯微鏡下觀察剛接種的骨髓中體積較大的單核細(xì)胞呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中。48 h少數(shù)細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣外形，以后細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)。3～4 d開始迅速生長(zhǎng)，12 d左右細(xì)胞達(dá)到單層匯合的80％～90％，細(xì)胞呈比較均一的梭形，成纖維樣細(xì)胞樣生長(zhǎng)，形成旋渦狀。
　　 2、小鼠移植皮膚存活時(shí)間：后3組皮膚移植物存活時(shí)間均比空白對(duì)照組延長(zhǎng)（P<

6、0.05）：CP組與SD-BMSCs組比較，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；CP+SD-BMSCs組與CP組和SD-BMSCs組比較，皮膚移植物存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CP+SD-BMSCs組皮片存活最長(zhǎng)達(dá)18 d。
　　 3、組織學(xué)觀察皮膚移植后7 d大體觀察發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組大部分已經(jīng)結(jié)痂壞死，CP組存活尚好，SD-BMSCs組可見已有局部小潰瘍，而CP+SD-BMSCs組存活良好。HE染色觀

7、察：空白對(duì)照組皮膚有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無血管形成：CP組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少，并有少量血管形成；SD-BMSCs組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也較多，但有新生血管形成；CP+SD-BMSCs組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少，同時(shí)也有血管生成。
　　 4、CM-DiI熒光標(biāo)記SD-BMSCs移植后的觀察：CM-DiI熒光染料染色后細(xì)胞大部分著色，繼續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞具有良好的形態(tài)，并保持分裂狀態(tài)。尾靜脈注射后14 d肺組織內(nèi)依然觀察到大量熒光細(xì)胞，并且脾臟內(nèi)也觀察到大量熒

8、光細(xì)胞，同時(shí)移植皮膚內(nèi)也觀察到少量熒光細(xì)胞。30 d肺組織內(nèi)依然觀察到熒光細(xì)胞，其他器官?zèng)]有觀察到熒光細(xì)胞。
　　 5、SD-BMSCS流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果受體外周血單核細(xì)胞中SD-BMSCs的含量隨著時(shí)間的推移逐漸減少，7、14、30 d CP+SD-BMSCs組的細(xì)胞含量均高于SD-BMSCs組。
　　 6、混合淋巴細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)SD-BMSCs對(duì)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的T淋巴細(xì)胞的增殖具有抑制作用，隨著細(xì)胞比例的減小，

9、抑制作用逐漸減低。單獨(dú)淋巴細(xì)胞組與1：100組、淋巴細(xì)胞+MMC組與1:1組分別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其余各組間進(jìn)行比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05，n=5）。
　　 結(jié)論：
　　 1、BMSCs能夠在異種受體體內(nèi)存活較長(zhǎng)時(shí)間；
　　 2、第三方BMSCs能夠延長(zhǎng)同種異體移植物的存活時(shí)間，并且和免疫抑制劑具有協(xié)同作用；
　　 3、BMSCs能夠抑制異種T淋巴細(xì)胞的活化增殖，而且隨著MS