影響豬胚胎附植及胎盤褶皺發(fā)育相關(guān)基因的鑒定.pdf

1、提高母豬產(chǎn)仔率以及斷奶前仔豬的成活率對提高養(yǎng)豬企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益有重要影響。在附植期，胚胎死亡率可達(dá)25％左右，是影響產(chǎn)仔數(shù)的重要因素。胎盤形成后，胎盤效率直接影響著胎兒的發(fā)育。國內(nèi)梅山豬擁有高繁殖率的原因之一被認(rèn)為是其具有較高的胎盤效率。母胎界面胎盤褶皺的形成與發(fā)育是影響豬胎盤效率的重要因素。因此分析鑒定影響胚胎附植以及影響胎盤褶皺形成與發(fā)育的相關(guān)基因?qū)μ岣吣肛i產(chǎn)仔率和斷奶前仔豬成活率具有重要意義，能為高繁殖力母豬的培育提供有價值的育種素

2、材。本研究以純種大白豬和梅山豬的初產(chǎn)母豬為研究對象，選取母豬妊娠12、15、18、26、50、95天子宮和胎盤為實驗材料，通過表型組學(xué)分析不同妊娠階段及不同品種間子宮和胎盤的形態(tài)功能變化，通過檢測相關(guān)因子的定位定量表達(dá)來分析鑒定影響胚胎附植與胎盤褶皺發(fā)育的相關(guān)基因，得到以下結(jié)果:
　　1.影響豬胚胎附植相關(guān)基因的鑒定
　　豬附植時胚胎不侵入子宮內(nèi)膜中，而是胚胎滋養(yǎng)層上皮與子宮內(nèi)膜腔上皮相互粘附，因此粘附分子對胚胎成功附植至關(guān)

3、重要。免疫組化實驗證實粘附分子CD34在附植期間母胎界面上皮細(xì)胞中表達(dá)，且其蛋白的陽性信號主要位于細(xì)胞膜上。在大白豬妊娠15天，CD34蛋白主要在胚胎滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞中表達(dá)，而在子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。在妊娠26天，CD34蛋自在整個母胎界面上皮雙分子層中表達(dá)。說明CD34蛋白可能參與胚胎與子宮內(nèi)膜的粘附。
　　另外，附植期胚胎需要分泌大量的雌激素作為母體妊娠識別信號，需要從母體轉(zhuǎn)運大量的雌激素合成前體物質(zhì)-膽固醇，因此膽固

4、醇轉(zhuǎn)運載體對胚胎附植具有重要作用。結(jié)果顯示ABCA1在大白豬和梅山豬妊娠12、15、和18天中表達(dá)于子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞，但幾乎不表達(dá)于子宮腺體和胚胎滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞中。ABCA1蛋白在豬子宮系膜側(cè)（胚胎附植側(cè)）的表達(dá)量強于系膜對側(cè)。SR-BI蛋白在大白豬和梅山豬子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞、腺體上皮細(xì)胞以及滋養(yǎng)層細(xì)胞中都表達(dá)，且其在子宮系膜側(cè)和系膜對側(cè)的表達(dá)量沒有顯著不同。膽固醇合成通路限速酶HMGCRmRNA在妊娠12和15天胚胎中的表達(dá)很弱，說

5、明胚胎自身合成膽固醇的能力很弱。這些結(jié)果說明了膽固醇從母體向胚胎轉(zhuǎn)運的路徑，并且表明ABCA1還對胚胎向系膜側(cè)定向附植可能發(fā)揮重要作用。
　　2.豬胎盤褶皺發(fā)育的機(jī)制探究
　　胎盤褶皺的形成迅速增大了母胎界面營養(yǎng)物質(zhì)的交換面積，極大地提高了母胎營養(yǎng)物質(zhì)交換效率，即胎盤效率。我們系統(tǒng)檢測了具有胎盤效率差異的不同品種母豬妊娠過程中母胎界面的表型組，并且初步研究了調(diào)控胎盤褶皺發(fā)育的分子機(jī)制。
　　2.1與大白豬相比，梅山豬妊

6、娠后期胎盤滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞增殖能力更強，褶皺復(fù)雜度更高
　　形態(tài)學(xué)測量發(fā)現(xiàn)，隨著妊娠的進(jìn)行，每單位面積胎盤褶皺的長度（褶皺復(fù)雜度）顯著增加。在妊娠95天，梅山豬胎盤褶皺復(fù)雜度顯著大于大白豬褶皺復(fù)雜度。滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞在褶皺發(fā)育過程中分化成柱狀上皮和立方狀上皮。大白豬和梅山豬滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞在妊娠26天時都為柱狀，但在妊娠50天時分化為高柱狀（褶皺頂端）和立方狀（褶皺底端和側(cè)面）。在妊娠95天時梅山豬所有滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞都變成立方狀而大白豬

7、褶皺頂端滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞仍為高柱狀。細(xì)胞增殖標(biāo)記分子Ki67結(jié)果顯示褶皺頂端的高柱狀滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞增殖能力弱，而褶皺底端細(xì)胞增殖能力強。用來指示細(xì)胞分泌糖原、糖蛋白等大分子物質(zhì)的PAS染色的陽性信號主要在高柱狀滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞中分布。以上結(jié)果揭示了梅山豬比大白豬具有更高胎盤效率的另一機(jī)制。梅山豬妊娠后期胎盤褶皺復(fù)雜度更高，物質(zhì)交換面積得到補償。其次，研究結(jié)果表明增殖能力強的立方狀滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞可能具有促進(jìn)胎盤褶皺發(fā)育的功能。
　　2.

8、2 ZEB2介導(dǎo)的信號通路通過調(diào)控滋養(yǎng)層上皮分化而促進(jìn)褶皺的發(fā)生和發(fā)育
　　E-cadherin表達(dá)高的上皮細(xì)胞細(xì)胞間粘附緊密，遷移能力弱，分泌能力強。結(jié)果表明，E-cadherin在褶皺頂端的高柱狀滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞中高表達(dá)，在褶皺底端和側(cè)面的滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，且陽性信號分布于細(xì)胞膜。妊娠95天，大白豬褶皺頂端滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞仍表達(dá)E-cadherin，而梅山豬所有滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞都幾乎不表達(dá)E-cadherin。β-cate

9、nin分子與E-cadherin的表達(dá)模式一致。ZEB1和ZEB2轉(zhuǎn)錄因子可以通過抑制E-cadherin在上皮細(xì)胞中的表達(dá)來調(diào)控上皮細(xì)胞的分化。結(jié)果顯示ZEB2表達(dá)模式與E-cadherin恰好相反，且陽性信號位于細(xì)胞核中。而ZEB1在滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞中不表達(dá)。說明在豬滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞中調(diào)控E-cadherin表達(dá)的是ZEB2而非ZEB1。表達(dá)ZEB2但不表達(dá)E-cadherin的立方狀滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞能表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)記分子Cytokera

10、tin，且不表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記分子Vimentin。說明立方狀滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞仍維持上皮細(xì)胞特性，從而維持胎盤屏障的存在。
　　2.3基質(zhì)重塑相關(guān)基因?qū)︸薨櫚l(fā)育的影響
　　黏著斑相關(guān)蛋白FAK、Paxillin以及integrin-αv在胎盤滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞中都幾乎不表達(dá)，但是FAK蛋白在妊娠26天靠近胎盤褶皺的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，說明此區(qū)域的胞外基質(zhì)硬度高(stiffer)。由于大部分細(xì)胞都具有“趨硬性”(Durotaxi

11、s)即細(xì)胞偏向細(xì)胞外基質(zhì)硬度高的一側(cè)遷移。胎盤滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞可能會偏向于向這部分胞外基質(zhì)硬度高的區(qū)域遷移，從而促進(jìn)褶皺的形成。另外，HAI-1在上皮細(xì)胞中能通過調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的活性來調(diào)控組織重塑，細(xì)胞的分化與遷移等生物學(xué)過程。免疫組化結(jié)果顯示HAI-1蛋白表達(dá)模式與E-cadherin類似。在胎盤高柱狀滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞中高表達(dá)，而在立方狀滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)。熒光定量PCR的結(jié)果顯示妊娠50天胎盤組織中的表達(dá)量最高。另外發(fā)