二花臉豬TGFBR2基因的克隆與表達(dá)水平分析.pdf

1、二花臉豬是我國太湖豬中最優(yōu)秀的品種之一，以繁殖力高而聞名，但其高繁殖力遺傳機(jī)制尚不明確。TGFBR2基因是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族中的一員，在哺乳動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞增殖、分化、卵泡發(fā)育和繁殖性能等方面發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于TGFBR2基因與二花臉豬繁殖性能關(guān)系方面的研究還未見報(bào)道。本研究擬以我國高繁殖力豬種二花臉豬為研究對(duì)象，采用克隆測(cè)序技術(shù)獲得二花臉豬TGFBR2基因編碼區(qū)序列，并利用生物信息學(xué)方法分析其序列特征;采用RT-PCR技術(shù)和免疫

2、組化技術(shù)分析二花臉豬TGFBR2基因的組織表達(dá)特征和卵巢組織細(xì)胞表達(dá)特征，并采用real-time PCR技術(shù)和western blot技術(shù)檢測(cè)二花臉豬與商品豬卵巢組織中TGFBR2基因mRNA和蛋白表達(dá)水平;采用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)豬卵泡閉鎖過程中TGFBR2基因mRNA表達(dá)水平的變化;采用生物信息學(xué)方法和熒光素酶雙報(bào)告基因系統(tǒng)篩選TGFBR2基因的調(diào)控miRNA。探討TGFBR2基因與二花臉豬高繁殖力性狀形成之間的的關(guān)

3、系，為揭示二花臉豬高繁殖力性狀形成的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。全文研究結(jié)果如下:
　　 1.二花臉豬TGFBR2基因的克隆和序列分析
　　 本研究成功獲得了二花臉豬TGFBR2基因的編碼區(qū)序列，序列全長(zhǎng)為1461bp，與哺乳動(dòng)物其它物種的一致性為74-84％。二花臉豬TGFBR2基因編碼蛋白含486個(gè)氨基酸殘基，與哺乳動(dòng)物其它物種的一致為88-97％。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，二花臉豬TGFBR2蛋白與人、小鼠等哺乳動(dòng)物一樣，含有跨膜

4、結(jié)構(gòu)域、Pkc結(jié)構(gòu)域等典型的功能域。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示二花臉豬TGFBR2蛋白由6個(gè)α-螺旋、7個(gè)β-疊結(jié)構(gòu)和不規(guī)則卷曲組成。利用TGFBR2氨基酸序列構(gòu)建的哺乳動(dòng)物NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類結(jié)果與經(jīng)典分類學(xué)相吻合。研究結(jié)果表明二花臉豬TGFBR2基因與哺乳動(dòng)物其它物種同源性較高，推測(cè)其與其它哺乳動(dòng)物TGFBR2蛋白類似，在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。
　　 2.二花臉豬TGFBR2表達(dá)特征和卵巢組織表達(dá)水平
　　 RT-PC

5、R檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TGFBR2基因在二花臉豬下丘腦、垂體、卵巢等12種組織中廣泛表達(dá)，特別是在卵巢組織中高表達(dá)。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)TGFBR2在豬卵泡的各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)，主要分布在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中。Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二花臉豬卵巢組織中TGFBR2基因mRNA表達(dá)水平顯著高于商品豬(P＜0.05)。Westernblot分析發(fā)現(xiàn)二花臉豬卵巢組織中TGFBR2蛋白表達(dá)水平顯著高于商品豬(P＜0.05)。研究結(jié)果表明卵巢組織中T

6、GFBR2基因和蛋白表達(dá)水平可能與二花臉豬的高繁殖力有關(guān)，是影響二花臉高繁殖力性狀形成的候選基因。Real-time PCR法對(duì)豬健康卵泡、早期閉鎖卵泡和晚期閉鎖卵泡中TGFBR2基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了分析，研究結(jié)果表明TGFBR2基因與豬卵泡早期閉鎖有一定的關(guān)系，可能通過影響卵泡液中E2的合成影響卵泡閉鎖。
　　 3.豬TGFBR2基因調(diào)控miRNA的初步篩選
　　 根據(jù)生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)，獲得了29個(gè)調(diào)控TGFB

7、R2基因的候選miRNA，結(jié)合課題組前期利用miRNA芯片檢測(cè)豬卵泡閉鎖過程中miRNA表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21既是TGFBR2基因的候選調(diào)控miRNAs，也是豬卵泡閉鎖過程中差異表達(dá)的miRNAs(P＜0.000001)。將miR-21 minics和構(gòu)建的TGFBR2基因3'UTR熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24h和48h后，miR-21 minics組報(bào)告基因的活性極顯著低于對(duì)照組（minics NC組