慢病毒介導CYP3A11基因knock-down小鼠的建立.pdf

1、一、研究目的及背景
　　 細胞色素P450(cytochrome,CYP450)是藥物代謝中一類重要的代謝酶,約60％普通處方藥需要通過P450酶進行生物轉(zhuǎn)化。而在P450中最重要的就是CYP3A亞家族,它們是哺乳動物體內(nèi)藥物生物轉(zhuǎn)化的主要酶系,參與內(nèi)源性物質(zhì)的生物合成、代謝以及外源性物質(zhì)的氧化代謝。
　　 一直以來,P450酶的基因調(diào)控研究的難題是在體外沒有一個有代表性的動物代謝模型模擬人P450酶的各個水平的變化。目

2、前實驗動物模型大多只能在某一代謝反應上近似地模擬人類,但與人總有一些差異。小鼠是目前常用的藥物臨床前安全性評價模式動物,但由于P450酶的種屬差異,從而限制了小鼠試驗結(jié)果的前瞻性與可比性。為了克服種屬差異,建立表達人P450酶的人源化轉(zhuǎn)基因小鼠是目前常用的策略,但小鼠內(nèi)源性P450酶可顯著地干擾所轉(zhuǎn)入的人P450酶的功能,極大限制了此類模型的應用。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指由內(nèi)源性或外源

3、性與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補序列的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介導、在細胞內(nèi)特異地降解靶基因mRNA、從而致使靶基因表達降低或封閉的生物學過程。若能通過以小鼠3A亞家族P450酶基因保守序列中與人3A亞家族P450酶基因編碼序列同源性低的差異位點為RNA干擾靶點,構(gòu)建miRNA分子表達載體,建立體內(nèi)RNA干擾轉(zhuǎn)基因小鼠模型,在不影響所轉(zhuǎn)入的人P450酶表達的前提下,在小鼠體內(nèi)特異性、整體性

4、地抑制內(nèi)源性3A亞家族P450酶的表達,由此消除小鼠內(nèi)源性P450酶對所轉(zhuǎn)入的人P450酶功能的干擾,為建立一系列人源化程度更高的人3A亞家族P450酶轉(zhuǎn)基因小鼠提供工具小鼠,則其藥物代謝過程將和人類非常相似,將為藥物的安全與有效性評價將提供極佳的研究模型。
　　 本研究選擇慢病毒表達系統(tǒng),通過構(gòu)建和篩選抑制P4503A11表達的miR30-based shRNA的慢病毒載體,并在體外篩選干擾效率最高的重組慢病毒,再通過卵周隙顯

5、微注射這一病毒建立P4503A11基因沉默小鼠,為構(gòu)建小鼠P4503A亞家族其它基因的干擾載體并為最終制備CYP3A亞家族人源化小鼠奠定了基礎。
　　 二、研究內(nèi)容及結(jié)果
　　 在第一部分,本課題以慢病毒載體FUW為骨架,構(gòu)建了表達針對CYP3A11基因基于miR30-shRNA分子的重組慢病毒載體FUW-GFPmiR-shRNA;通過“三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)”、利用293FT細胞包裝重組慢病毒載體FUW-GFPmiR-shRN

6、A,獲得高滴度的重組慢病毒懸液;利用FVBN近交系小鼠的原代培養(yǎng)肝細胞,對構(gòu)建的重組慢病毒載體的干擾效率進行了檢測,初步篩選出具備較高效率的重組慢病毒。結(jié)果:
　　 1.通過miR-shRNA在線設計軟件(http://katahdin.cshl.org:9331/siRNA/RNAi.Cgi?type=shRNA),設計了三個針對位于小鼠CYP3A11保守序列中與人CYP3A亞家族基因序列同源性低的位點的miR-shRNA分子

7、;通過DNA重組,以慢病毒載體FUW為骨架,構(gòu)建了miR30-based shRNA重組慢病毒表達載體,通過酶切鑒定與測序檢測確證了重組的準確性。
　　 2.通過“三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)”,利用293FT細胞分別包裝上述構(gòu)建的重組慢病毒載體,并通過“二步超速離心法”濃縮病毒懸液,獲得了＞109的高滴度的重組慢病毒液;分離培養(yǎng)了FVB/N近交系小鼠原代肝細胞,利用濃縮的重組慢病毒液感染肝細胞,通過RT-PCR檢測重組慢病毒載體對靶基因的干

8、擾效應。結(jié)果表明,相對于未轉(zhuǎn)染組及陰性轉(zhuǎn)染組,FUW-GFP-MiR-shRNA1,2轉(zhuǎn)染FVB/N小鼠肝細胞后,MiR-shRNA1的抑制效率則可達到(74.9±0.92)％,MiR-shRNA2可抑制(55.3±1.06)％CYP3A11基因mRNA的表達(P＜0.05)。
　　 在第二部分,開展了通過慢病毒載體介導、結(jié)合卵周隙顯微注射、以eGFP為報告基因制備CYP3A11基因沉默小鼠、檢測小鼠體內(nèi)CYP3A11基因干擾效

9、率的研究,探討了通過卵周隙顯微注射重組慢病毒研制CYP3A11基因沉默小鼠的效率及小鼠體內(nèi)基因沉默的效率。結(jié)果:
　　 1.通過在紫外燈下觀察小鼠耳廓皮膚可見eGFP特征性綠色熒光,該結(jié)果也表明目的基因已在小鼠體內(nèi)表達。
　　 2.通過檢測首建小鼠基因組的DNA,目的基因已經(jīng)正確整合至轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中。
　　 3.通過熒光定量PCR分析,顯示小鼠的肝臟CYP3A11基因干擾效率為72.7％,表明由慢病毒介導的m

10、iRNA分子得以表達并顯著地減少目的基因的表達。
　　 三、研究結(jié)論
　　 CYP3A11的miRNA慢病毒載體FUW-GFP-MiR-shRNA構(gòu)建成功,將其包裝成重組慢病毒。通過三質(zhì)粒慢病毒包裝體系,獲得了滴度均＞1×109TU/ml以上的注射用重組慢病毒。重組慢病毒載體FUW-GFP-MiR-shRNA,尤其是shRNA1,能夠顯著的抑制小鼠肝細胞CYP3A11基因mRNA的表達。通過慢病毒轉(zhuǎn)基因系統(tǒng),建立了特異性