應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)RNA干擾在MCF-7細(xì)胞中剔降IKKα基因和制備轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究.pdf

1、近年研究表明，乳腺腫瘤細(xì)胞中，IκB激酶-α(IκBkinase-α，IKKα)對(duì)激活NF-κB乃至其后的病變發(fā)揮著極其重要的作用。腫瘤壞死因子家族成員receptoractivatorofNF-κBligand(RANKL)與其受體(RANK)結(jié)合，激活I(lǐng)KKα蛋白，釋放NF-κB蛋白轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。在核內(nèi)促使CyclinD1的表達(dá)，若該表達(dá)持續(xù)進(jìn)行將會(huì)導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞的增生、癌變。該通路是經(jīng)典的TNFR-IKKβ-NF-κB及LT-

2、IKKα-NF-κB通路之外的另一重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，稱之為RANKL-IKKα-NF-κB通路。它的異常表達(dá)是導(dǎo)致乳腺腫瘤形成的早期事件之一。本課題針對(duì)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要樞紐因子IKKα，通過(guò)應(yīng)用慢病毒載體(lentiviralvector)介導(dǎo)的RNAi效應(yīng)，剔降(knockdown)乳腺腫瘤細(xì)胞MCF-7的IKKαmRNA，使其表達(dá)量下降，從而降低下游NF-κB蛋白的過(guò)度激活，以至恢復(fù)到正常水平，避免乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

3、 此外，采用慢病毒載體感染受精卵方法，取代傳統(tǒng)顯微注射，建立了表達(dá)IKKα基因剔降的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，目前已繁殖至F2代。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)驗(yàn)證，轉(zhuǎn)基因小鼠血液中IKKαmRNA水平，明顯低于野生型小鼠。該模型的建立為在體內(nèi)開(kāi)展IKKα基因的生物學(xué)功能及其與腫瘤發(fā)生關(guān)系的研究創(chuàng)造良好條件。上述研究工作在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。 課題研究的內(nèi)容包括以下四個(gè)主要部分： 1.pU6-IKKα-knockdown表達(dá)載體

4、構(gòu)建。 2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pU6-IKKα-knockdown表達(dá)載體剔降MCF-7細(xì)胞中IKKα的mRNA的研究。 3.IKKα-knockdown慢病毒載體的構(gòu)建、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及用于乳腺腫瘤基因治療的初步觀察。 4.慢病毒載體感染受精卵制備IKKα-knockdown轉(zhuǎn)基因小鼠的研究。 研究方法： 1.特異性dsoligo通過(guò)去磷酸化、退火、連接、裝配至pENT/U6載體中，獲得pENT/U6-IKKα

5、vector，隨后通過(guò)λ噬菌體特異性的LR重組技術(shù)，獲得pU6-IKKα-knockdown表達(dá)載體。 2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pU6-IKKα-knockdown表達(dá)載體至MCF-7細(xì)胞中，通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)等實(shí)驗(yàn)，鑒定IKKα及其下游NF-κB蛋白的表達(dá)水平，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)NF-κB的活性。 3.IKKα-knockdown慢病毒載體的構(gòu)建、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及用于乳腺腫瘤的基因治療。研究方法包

6、括： 1)pU6-IKKα-knockdown表達(dá)載體和ViraPowerPackgingMix共轉(zhuǎn)染293FT包裝細(xì)胞，產(chǎn)生IKKα-knockdown慢病毒(IKKα-knockdown-lentivirus)。 2)超速離心濃縮IKKα-knockdown-lentivirus和結(jié)晶紫染色法檢測(cè)病毒滴度。 3)稻瘟菌素(Blasticidin)抗性篩選法制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IKKα-knockdown-lentiv

7、irus的MCF-7細(xì)胞株。 4)采用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、Westernblotting和免疫熒光組織染色法觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中IKKα的RNAi效應(yīng)及IKKα的基因表達(dá)的干擾對(duì)下游NF-κB活性的影響； 5)將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞株腋下注射至裸鼠體內(nèi)，觀察RNAi效應(yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞成瘤性的影響。 4.IKKα-knockdown-lentivirus介導(dǎo)的基因剔降轉(zhuǎn)基因小鼠的制備。應(yīng)用三種不同的方法制

8、備轉(zhuǎn)基因小鼠模型： 1)用針尖注射病毒顆粒至受精卵透明帶下。 2)PIEZO注射病毒顆粒至受精卵透明帶下。 3)針尖注射病毒顆粒到受精卵透明帶下，再將處理后受精卵與含病毒的介質(zhì)中過(guò)夜培養(yǎng)。 結(jié)果與討論： 1.限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列測(cè)定pU6-IKKα-knockdown表達(dá)載體證實(shí)，目的片段已正確插入載體且插入片段序列正確。 2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)證實(shí)：pU6-IKKα-knockd

9、own表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞24h和48h，均可導(dǎo)致IKKαmRNA水平明顯下降。同時(shí)胞漿IKKα蛋白水平下降。對(duì)IKKα的干擾效應(yīng)造成了細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白水平下降，而72h這一時(shí)間點(diǎn)IKKα蛋白表達(dá)恢復(fù)正常。由于受到IKKα表達(dá)水平的下調(diào)，導(dǎo)致其下游的NF-κB蛋白亞基p65的表達(dá)也受到不同程度的影響。在剔降效應(yīng)消失時(shí)，其后續(xù)的作用仍然得以維持。導(dǎo)致在72h這一時(shí)間點(diǎn)，IKKα蛋白已恢復(fù)正常時(shí)，p65蛋白表達(dá)仍然低于正常水平，同時(shí)

10、NF-κB蛋白促基因轉(zhuǎn)錄活性也隨之降低。 3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)證實(shí)：IKKα-knockdown-lentivirus滴度達(dá)到10TU/ml，該病毒感染MCF-7細(xì)胞經(jīng)篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，出現(xiàn)了明顯的IKKα基因剔降效應(yīng)，并導(dǎo)致下游p65蛋白核內(nèi)水平下降。4周齡裸鼠腋下接種IKKα-knockdown-MCF-7細(xì)胞1周后，腫瘤體積明顯小于對(duì)照組。 4.采用慢病毒透明帶下感染受精卵的方式制備轉(zhuǎn)基因小鼠模型，經(jīng)PCR

11、檢測(cè)表明三種方法制備的首建鼠陽(yáng)性率分別為7.69％，12.28％,18.45％。F1代轉(zhuǎn)基因小鼠的陽(yáng)性率為36.25％。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)，F(xiàn)2代轉(zhuǎn)基因小鼠血液中IKKα的mRNA水平，均低于野生型。 研究結(jié)論： 1.成功構(gòu)建pU6-IKKα-knockdown表達(dá)載體，該載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7證實(shí)，設(shè)計(jì)的dsoligo轉(zhuǎn)錄成對(duì)應(yīng)的shRNA，可在短期時(shí)間內(nèi)剔降了IKKαmRNA，并能顯著抑制p65蛋白

12、核內(nèi)含量。促進(jìn)NF-κB下游基因轉(zhuǎn)錄活性下降。 2.研究制備的表達(dá)IKKα基因剔降shRNA的復(fù)制缺陷型慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后獲得了穩(wěn)定表達(dá)IKKα基因剔降作用的MCF-7細(xì)胞株(IKKα-knockdownMCF-7)。該細(xì)胞株具有明顯的IKKαmRNA剔降效應(yīng)，其核內(nèi)p65蛋白水平下降，細(xì)胞株在裸鼠體內(nèi)的成瘤性下降。 3.IKKα-knockdown-lentivirus感染受精卵成功制備轉(zhuǎn)基因小鼠模型，轉(zhuǎn)基因小