填肥朗德鵝PBEF-Nampt-Visfatin基因cDNA的全序列擴增及RT-PCR表達分析.pdf

1、PBEF/Nampt/Visfatin是2005年日本學者新發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，位于染色體7q22.1和7q31.33之間，長37.41kb;在進化過程中高度保守，細菌、脊椎動物海綿動物門、魚類中都有同源蛋白。目前其相關功能及作用機制不明，現(xiàn)認為主要作用為直接降低血糖的作用，作用效用約為胰島素的1/10。與肥胖與2型糖尿病等代謝性疾病緊密相關。
　　 本實驗通過采用特殊動物模型--朗德鵝，應用強制填飼技術建立腹型肥胖動物模型，分

2、析了填飼前后朗德鵝各項生理指標及血糖、血脂指標，以及其代謝紊亂狀態(tài)。應用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術檢測肥胖組和正常生長組PBEF/Nampt/Visfatin基因脂肪、肝臟等13處組織的表達狀況，建立了組織表達譜，并進行了兩組表達差異分析?？寺×死实蛮ZPBEF/Nampt/Visfatin基因部分序列，并根據該序列應用RACE(cDNA末端快速擴增技術，rapid-amplificationofcDNAends)獲得了朗德鵝

3、PBEF/Nampt/Visfatin的cDNA全序列并做了相關分析。
　　 1．動物模型的建立及相關指標分析
　　 方法：使用90日齡朗德鵝公鵝30只，隨機平均分為2組籠養(yǎng)。填肥組高頻填飼高能玉米，對照組自由采食普通飼料，兩組均自然采水。21天后測量體重（活重）、肝重、腹脂重；檢測血脂七項（總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固、低密度脂蛋白膽固醇、脂蛋白、游離脂肪酸、磷脂）、血糖。并獲得組織樣本，液氮凍存后備用。

4、>　　 結果：填肥組較對照組體重、肝重、腹脂重(p＜0.01)極顯著增高，血糖顯著增高(P＜0.05)，血甘油三酯(P＜0.01)、總膽固醇和游離脂肪酸(P＜0.05)顯著增高，兩組間高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、膽固醇，脂蛋白和磷脂等指標兩組無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)；
　　 對照組中各參數(shù)相關性如下：肝重與腹脂重、肝重與磷脂呈極顯著正相關性、脂蛋白a與總膽固醇呈極顯著負相關性；高密度脂蛋白膽固醇與甘油三酯呈顯著負相關性、低

5、密度脂蛋白膽固醇與腹脂重呈顯著正相關性、游離脂肪酸與肝重呈顯著正相關性、游離脂肪酸與總膽固醇呈顯著正相關性。其他指標見未見顯著相關性。
　　 填肥組中各參數(shù)相關性如下：體重與腹脂重顯著正相關性，總膽固醇與體重顯著負相關性，余指標未見明顯相關性。
　　 2．建立組織表達譜及填肥組與對照組差異分析
　　 方法：Trizol技術提取各組織mRNA，根據NCBI上雞PBEF/Nampt/Visfatin基因全序列上保守段

6、設計引物，逆轉錄獲得cDNA序列，克隆擴增獲得精確部分朗德鵝PBEF/Nampt/Visfatin序列，根據此段精確序列設計熒光定量專用引物，應用RT-PCR技術獲得組織表達數(shù)據，通過2-△△方法分析得出兩組各組織的表達差異。
　　 結果：各組織中PBEF/Nampt/Visfatin基因均有不同程度表達，對照組與填肥組中肌肉組織表達均較高（胸肌、腿肌、心?。?，脾、胰等實質器官組織表達均較低；表達量高低如下：對照組：胸肌、腎、心

7、肌、腿肌、腹脂、胃、腦、皮下脂肪、腸、肝、胰、肺、脾；填肥組：胸肌、腿肌、心肌、肝臟、腹脂、腎、胃、肺、皮下脂肪、腦、脾、胰、腸。PBEF/Nampt/Visfatin基因表達量填肥組與對照組表達量半定量結果顯示，肥胖后脾臟與肝臟PBEF/Nampt/Visfatin基因表達增加，分別為對照組的6.8-38.05與5.57-6.94倍，小腸表達量減少，填肥組約為對照組的10％-39％;余組織個體差異較大，倍比關系不明顯。
　　

8、3．PBEF/Nampt/Visfatin全序列的獲得及分析
　　 方法：根據前述獲得PBEF/Nampt/Visfatin已知序列設計引物，使用cDNA末端快速擴增(RACE)技術，克隆測序獲得全序列；通過在線核酸序列資源庫進行氨基酸序列及蛋白結構預測，并進行各物種間該基因相似性比較。
　　 結果：獲得PBEF/Nampt/VisfatincDNA編碼區(qū)序列1481bp，鵝該基因與各物種相似性非常高。
　　 結