填肥朗德鵝PBEF-Nampt-Visfatin基因cDNA的全序列擴增及RT-PCR表達分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、PBEF/Nampt/Visfatin是2005年日本學者新發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子,位于染色體7q22.1和7q31.33之間,長37.41kb;在進化過程中高度保守,細菌、脊椎動物海綿動物門、魚類中都有同源蛋白。目前其相關功能及作用機制不明,現(xiàn)認為主要作用為直接降低血糖的作用,作用效用約為胰島素的1/10。與肥胖與2型糖尿病等代謝性疾病緊密相關。
   本實驗通過采用特殊動物模型--朗德鵝,應用強制填飼技術建立腹型肥胖動物模型,分

2、析了填飼前后朗德鵝各項生理指標及血糖、血脂指標,以及其代謝紊亂狀態(tài)。應用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術檢測肥胖組和正常生長組PBEF/Nampt/Visfatin基因脂肪、肝臟等13處組織的表達狀況,建立了組織表達譜,并進行了兩組表達差異分析??寺×死实蛮ZPBEF/Nampt/Visfatin基因部分序列,并根據該序列應用RACE(cDNA末端快速擴增技術,rapid-amplificationofcDNAends)獲得了朗德鵝

3、PBEF/Nampt/Visfatin的cDNA全序列并做了相關分析。
   1.動物模型的建立及相關指標分析
   方法:使用90日齡朗德鵝公鵝30只,隨機平均分為2組籠養(yǎng)。填肥組高頻填飼高能玉米,對照組自由采食普通飼料,兩組均自然采水。21天后測量體重(活重)、肝重、腹脂重;檢測血脂七項(總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固、低密度脂蛋白膽固醇、脂蛋白、游離脂肪酸、磷脂)、血糖。并獲得組織樣本,液氮凍存后備用。

4、>   結果:填肥組較對照組體重、肝重、腹脂重(p<0.01)極顯著增高,血糖顯著增高(P<0.05),血甘油三酯(P<0.01)、總膽固醇和游離脂肪酸(P<0.05)顯著增高,兩組間高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、膽固醇,脂蛋白和磷脂等指標兩組無統(tǒng)計學差異(p>0.05);
   對照組中各參數(shù)相關性如下:肝重與腹脂重、肝重與磷脂呈極顯著正相關性、脂蛋白a與總膽固醇呈極顯著負相關性;高密度脂蛋白膽固醇與甘油三酯呈顯著負相關性、低

5、密度脂蛋白膽固醇與腹脂重呈顯著正相關性、游離脂肪酸與肝重呈顯著正相關性、游離脂肪酸與總膽固醇呈顯著正相關性。其他指標見未見顯著相關性。
   填肥組中各參數(shù)相關性如下:體重與腹脂重顯著正相關性,總膽固醇與體重顯著負相關性,余指標未見明顯相關性。
   2.建立組織表達譜及填肥組與對照組差異分析
   方法:Trizol技術提取各組織mRNA,根據NCBI上雞PBEF/Nampt/Visfatin基因全序列上保守段

6、設計引物,逆轉錄獲得cDNA序列,克隆擴增獲得精確部分朗德鵝PBEF/Nampt/Visfatin序列,根據此段精確序列設計熒光定量專用引物,應用RT-PCR技術獲得組織表達數(shù)據,通過2-△△方法分析得出兩組各組織的表達差異。
   結果:各組織中PBEF/Nampt/Visfatin基因均有不同程度表達,對照組與填肥組中肌肉組織表達均較高(胸肌、腿肌、心?。?,脾、胰等實質器官組織表達均較低;表達量高低如下:對照組:胸肌、腎、心

7、肌、腿肌、腹脂、胃、腦、皮下脂肪、腸、肝、胰、肺、脾;填肥組:胸肌、腿肌、心肌、肝臟、腹脂、腎、胃、肺、皮下脂肪、腦、脾、胰、腸。PBEF/Nampt/Visfatin基因表達量填肥組與對照組表達量半定量結果顯示,肥胖后脾臟與肝臟PBEF/Nampt/Visfatin基因表達增加,分別為對照組的6.8-38.05與5.57-6.94倍,小腸表達量減少,填肥組約為對照組的10%-39%;余組織個體差異較大,倍比關系不明顯。
  

8、3.PBEF/Nampt/Visfatin全序列的獲得及分析
   方法:根據前述獲得PBEF/Nampt/Visfatin已知序列設計引物,使用cDNA末端快速擴增(RACE)技術,克隆測序獲得全序列;通過在線核酸序列資源庫進行氨基酸序列及蛋白結構預測,并進行各物種間該基因相似性比較。
   結果:獲得PBEF/Nampt/VisfatincDNA編碼區(qū)序列1481bp,鵝該基因與各物種相似性非常高。
   結

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