靶向miR-126慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及意義.pdf

1、研究目的：
　　檢測(cè)微小RNA-126(MicroRNA-126，miR-126)在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatoryTcells，Tregs）中的表達(dá)水平，同時(shí)構(gòu)建基于慢病毒的miR-126反義寡核苷酸序列(antisenseoligonucleotides，ASOs)表達(dá)載體，研究重組的病毒對(duì)Tregs外周誘導(dǎo)的作用，為進(jìn)一步研究miR-126對(duì)Tregs的生物學(xué)功能的調(diào)控作用和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　研究

2、方法：
　　實(shí)時(shí)定量PCR特異性探針法檢測(cè)miR-126在Tregs中的表達(dá)水平;針對(duì)miR-126序列，設(shè)計(jì)合成其ASOs序列，退火后連接至經(jīng)AgeI酶和EcoRI酶雙酶切的pGCsil-LV-GFP載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的載體（命名為pGCsil-miR-126-ASOs）進(jìn)行測(cè)序分析;將構(gòu)建成功的pGCsil-miR-126-ASOs表達(dá)質(zhì)粒和pHelper1.0、pHelper2.0質(zhì)

3、粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，濃縮病毒顆粒并測(cè)定所獲病毒滴度;將制備好的病毒顆粒感染TGF-β體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠CD4+CD62L+初始T細(xì)胞，72h后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其Foxp3的表達(dá)變化。
　　研究結(jié)果：
　　實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示miR-126在Tregs中的表達(dá)明顯高于CD4+CD25-T細(xì)胞(P＜0.01);測(cè)序結(jié)果證明成功構(gòu)建pGCsil-miR-126-ASOs重組質(zhì)粒載體，包裝并獲得高濃度的慢病毒顆粒，病毒滴度為9×