基于核酸短暫雜交和磁分離技術(shù)的單堿基突變檢測方法.pdf

1、單核苷酸突變(single-nucleotide mutation，SNM)已被證明與人類的多種疾病相關(guān)，因此開發(fā)可靠的單核苷酸突變檢測方法對于分子診斷和個體化醫(yī)療至關(guān)重要。由于夾心法低成本和檢測速度快的特點，目前廣泛應(yīng)用于核酸生物標志物的檢測，然而，在室溫下信號探針的雜交特異性差阻礙了突變體和野生體基因的有效區(qū)分。本研究以磁珠動態(tài)夾心法為基礎(chǔ)開發(fā)出一種基于信號探針與目標鏈之間短暫結(jié)合的SNM檢測方法。這種磁珠動態(tài)夾心法(dynamic

2、 sandwich assay，DSA)利用DNA短暫結(jié)合對單堿基錯配敏感的熱力學特性，能夠在較寬范圍的鹽離子濃度及室溫條件下實現(xiàn)對突變體較高的區(qū)分效果。
　　通過對磁珠粒子表面DNA雜交的研究，發(fā)現(xiàn)粒子表面高密度負電荷可以選擇性地削弱野生型雙鏈（單堿基錯配雙鏈）的穩(wěn)定性而對突變型雙鏈沒有明顯影響，因此本研究中使用的磁珠不僅可以作為一種分離工具，還可以提高SNM的選擇性;靈活的信號探針設(shè)計和簡單的磁分離操作使得該方法可以進行多種模

3、式的下游分析，包括比色法檢測和等溫擴增等。對于比色檢測來說，突變體存在下，ABTS-氧化產(chǎn)物呈現(xiàn)典型綠色并在410nm處有較強的吸收，而野生型沒有明顯變化。DSA基于富含G序列探針的檢出限為5nM;對于等溫擴增來說，5amol突變體在1h內(nèi)便能呈現(xiàn)特征擴增曲線，而野生型不顯示。DSA基于等溫指數(shù)擴增的檢出限為0.1fM;利用該方法對癌細胞提取基因組DNA中的BRAF D594G(c.1781A＞G)及BRAF V600E(c.1799T