芯片表面DNA分子機(jī)器的構(gòu)建與單堿基突變的檢測(cè).pdf

1、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，是指基因組DNA上某一個(gè)特定核苷酸位置上的單個(gè)堿基引起的變異，包括插入、刪除和堿基錯(cuò)配。SNPs與人類(lèi)遺傳病密切相關(guān)，對(duì)早期診斷，藥物響應(yīng)測(cè)試，疾病預(yù)防，和特定遺傳疾病的治療至關(guān)重要，因此SNPs研究已成為遺傳病學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。因此，發(fā)明一種簡(jiǎn)單，省時(shí)和高靈敏度的基因多樣性檢測(cè)的方法是非常有有價(jià)值和必要的。在此，我們提出了一種新穎的基于toehold協(xié)助下的表面增強(qiáng)鏈替換反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)單堿基突變檢測(cè)

2、的方法，整合界面檢測(cè)和溶液檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，首次將雙鏈DNA“toehold交換探針”接枝到芯片表面，利用雙偏振干涉技術(shù)(DPI)，借助toehold協(xié)助下的DNA鏈替換反應(yīng)原理實(shí)現(xiàn)了在芯片表面實(shí)時(shí)定量的研究單堿基突變的進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)單堿基突變?cè)谛酒砻娴臋z測(cè)的過(guò)程。不僅實(shí)現(xiàn)了DNA全序列不同位點(diǎn)以及不同突變類(lèi)型（插入、刪除、錯(cuò)配）的突變檢測(cè)，而且克服了溶液中正確的DNA目標(biāo)鏈替換效率低的缺點(diǎn)，大幅度提高了正確的DNA目標(biāo)鏈的替換效率（達(dá)到86.

3、1％）同時(shí)又能很好的抑制有突變的DNA目標(biāo)鏈的替換效率（約14％），大大提高了單堿基檢測(cè)信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)鏈濃度從0.8nM到1μM的單堿基突變檢測(cè)，檢測(cè)限為0.8nM。同時(shí)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單實(shí)用的DNA微陣列芯片，借助普通熒光顯微鏡，在玻璃芯片表面實(shí)現(xiàn)了高通量的單堿基突變檢測(cè)。
　　同時(shí)，DNA是一種多才多藝的極其優(yōu)秀功能材料，可以構(gòu)建具有特殊功能的納米結(jié)構(gòu)和納米器件。我們采用基于微流控的DNA微陣列技術(shù)，設(shè)計(jì)了新型的正交型微流

4、DNA微陣列芯片來(lái)實(shí)現(xiàn)DNA分子機(jī)器在芯片表面上的運(yùn)行?；贒NA鏈替換反應(yīng)原理以催化鏈catalyst和熒光報(bào)告鏈FAM-reporter兩種單鏈DNA為燃料，構(gòu)建兩種DNA分子機(jī)器，分別為DNA信號(hào)放大傳感器分子機(jī)器和DNA邏輯門(mén)分子機(jī)器。通過(guò)兩步的toehold協(xié)助下的DNA鏈替換反應(yīng)，一方面構(gòu)建了熒光信號(hào)放大的DNA信號(hào)放大傳感器;另一方面，利用正交型微流DNA微陣列成功的在芯片表面構(gòu)建了一個(gè)新型的“AND”邏輯門(mén)。
　　

5、最后，微流控技術(shù)是一種精確控制和操縱微升級(jí)（或納升級(jí)）液體在亞微米結(jié)構(gòu)的微通道中流動(dòng)技術(shù)。我們?cè)O(shè)計(jì)了新型流動(dòng)聚焦型微流控芯片。流體在微流通道中形成剪切流場(chǎng)（低雷諾數(shù)）。不同于宏觀體系，在剪切力和表面張力的競(jìng)爭(zhēng)作用下，產(chǎn)生的液滴在微尺度下的微流通道中形成特殊的排列現(xiàn)象---周期性類(lèi)似‘晶格’排列現(xiàn)象。重點(diǎn)關(guān)注在微流體系中液滴周期性圖案化排列和轉(zhuǎn)變機(jī)理性的分析和研究。我們研究了液滴排列模式的兩方面影響因素:水油兩相的流速比值（流體流速影響）

6、和微通道尺寸（幾何結(jié)構(gòu)影響）。當(dāng)微通道寬度為250μm或300μm時(shí)，液滴形成單層分散，雙層和單層擠壓排列。最重要的是，當(dāng)微通道寬度為350μm時(shí)，液滴會(huì)形成單層分散到三層排列到雙層擠壓最后到單層擠壓排列。當(dāng)出口通道寬度增加到400μm時(shí)，甚至出現(xiàn)了液滴四層排列的現(xiàn)象。于此同時(shí)，還仔細(xì)研究了各個(gè)液滴排列模式的“轉(zhuǎn)變點(diǎn)”和“過(guò)渡區(qū)”。我們的結(jié)果為乳化實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)詳細(xì)的策略來(lái)精確控制液滴大小和液滴模式，為合成分散或多分散的膠體粒子提供了理