新型單堿基突變檢測(cè)的壓電方法以及納米微囊探針的制備.pdf

1、當(dāng)前由于人們要揭開(kāi)疾病的遺傳機(jī)理以及提高醫(yī)療診斷和測(cè)試技術(shù)，對(duì)特定序列的DNA的分析檢測(cè)變的越來(lái)越重要，DNA序列檢測(cè)成為近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基因診斷的基礎(chǔ)。單堿基多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）是遺傳變異中最豐富的形式，大約每100-300個(gè)堿基就有一個(gè)堿基可能發(fā)生突變。許多病原性和遺傳性疾病都是和正?；駾NA序列的改變相關(guān)的，因此對(duì)這些單堿基突變的確認(rèn)就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)相關(guān)疾病的醫(yī)學(xué)診斷。

2、實(shí)現(xiàn)對(duì)這些基因單堿基突變的早期、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速的確認(rèn)，對(duì)于人類(lèi)相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理研究及早期治療具有非常重要的意義。目前，對(duì)于單鏈核苷酸以及單堿基突變的檢測(cè)方法有很多種。而這些傳統(tǒng)的方法普遍操作繁瑣費(fèi)時(shí)、不易定量、儀器昂貴、且對(duì)工作人員要求較高的專(zhuān)業(yè)技能，因此僅能在少數(shù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。開(kāi)發(fā)一些簡(jiǎn)便、價(jià)廉、精確且易于臨床推廣的方法是一件很有價(jià)值的工作，而就最近的研究表明由于壓電DNA生物傳感器具有操作簡(jiǎn)便，響應(yīng)迅速，靈敏度較高，價(jià)格低廉等特點(diǎn)

3、，已經(jīng)成為進(jìn)行核酸的結(jié)構(gòu)分析和單堿基突變檢測(cè)的重要手段，在本研究論文中，主要基于壓電石英晶振表面的質(zhì)量效應(yīng)，DNA連接酶反應(yīng)和納米顆粒放大效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)DNA目標(biāo)鏈中的單堿基突變檢測(cè)，主要內(nèi)容如下： 利用核酸標(biāo)記金納米顆粒，提出了一種基于DNA連接酶反應(yīng)和納米金放大效應(yīng)的壓電檢測(cè)方法，用于單堿基突變的檢測(cè)（第2章）。首先將巰基修飾的DNA捕獲探針固定在壓電石英晶振金電極表面；然后加入目標(biāo)鏈和金標(biāo)DNA探針，形成DNA雙鏈；經(jīng)連接酶連

4、接后加熱解鏈，當(dāng)目標(biāo)鏈和探針序列中有單堿基錯(cuò)配時(shí)，所形成的DNA雙鏈解鏈，晶振頻率將回復(fù)到固定捕獲探針時(shí)的數(shù)值，而目標(biāo)鏈和兩探針完全匹配時(shí)，則不發(fā)生解鏈，晶振頻率將不會(huì)回復(fù)到初始值,從而可以達(dá)到區(qū)分基因點(diǎn)突變的目的。該方法已成功的應(yīng)用于人工合成的β－地中海貧血基因密碼子17（CD17）的單堿基突變的檢測(cè)。與傳統(tǒng)的方法相比，該方法操作簡(jiǎn)便，快速，最小檢出值可以達(dá)到2.6 pmol/L,為基因突變疾病的臨床診斷提供了一種新手段。此后，我們又

5、將這一檢測(cè)體系的傳感器的再生及DNA鏈的純化進(jìn)行了改善（第3章）。簡(jiǎn)言之，5’端標(biāo)記有生物素的捕獲探針和3’端修飾有Fe3O4/Au磁性納米顆粒的檢測(cè)探針與目標(biāo)鏈進(jìn)行雜交，形成DNA雙鏈，經(jīng)過(guò)酶連后加熱解鏈，當(dāng)目標(biāo)鏈和探針有單堿基錯(cuò)配時(shí)，兩探針之間以及探針與目標(biāo)鏈解離,而對(duì)于完全匹配的目標(biāo)鏈，兩個(gè)探針不會(huì)解離，而當(dāng)解鏈后的DNA鏈與壓電石英晶振表面固定的BSA－脫硫生物素－親和素反應(yīng)，由于完全匹配的兩探針沒(méi)有解離，則捕獲探針5’端標(biāo)記有

6、的生物素可以和金電極的親和素反應(yīng)，引起電極表面質(zhì)量變化，從而引起頻率的降低，而對(duì)于不完全匹配目標(biāo)鏈，晶振表面頻率幾乎沒(méi)有變化，使用該方法，對(duì)b地中海貧血基因的-28位點(diǎn)突變的情況（這種突變是中國(guó)西南省份發(fā)病率最高的四種突變中的一種）成功地進(jìn)行了檢測(cè)。 分子信標(biāo)技術(shù)，由于其非標(biāo)記、靈敏且具有較高的選擇性等特點(diǎn)，已被證明是一種非常有用的核酸檢測(cè)方法。在第4章，我們發(fā)展了一種新的、基于分子信標(biāo)識(shí)體變構(gòu)控制的電化學(xué)通道法，用于DNA雜交

7、反應(yīng)的檢測(cè)。該方法靈敏、特異性好、無(wú)需標(biāo)記，并且可以很好地用于單堿基錯(cuò)配的區(qū)分。首先，將標(biāo)記有生物素（作為質(zhì)量放大信號(hào)分子）的分子信標(biāo)識(shí)體固定于壓電石英晶振的金電極表面，然后用巰基11酸封閉電極，形成分子印跡發(fā)夾結(jié)構(gòu)。對(duì)于完全匹配的目標(biāo)鏈，當(dāng)雜交反應(yīng)發(fā)生時(shí)，發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)被破壞，形成配基鍵合的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，生物素遠(yuǎn)離電極表面，當(dāng)與親和素反應(yīng)時(shí)，引起傳感器表面質(zhì)量顯著變化，頻率降低。而對(duì)于有單堿基突變的目標(biāo)鏈，則發(fā)夾結(jié)構(gòu)不會(huì)打開(kāi)，不能形成D

8、NA雙鏈結(jié)構(gòu)，當(dāng)加入親和素，由于環(huán)形探針的空間阻礙作用，生物素不會(huì)與親和素發(fā)生作用，電極表面的質(zhì)量變化不明顯，從而頻率也沒(méi)有明顯的下降。使用該方法對(duì)包含第142位密碼子的α-地中海貧血基因片斷進(jìn)行了分析，濃度檢測(cè)動(dòng)態(tài)線(xiàn)性范圍為1.41×10-11-1.41×10-7M，檢測(cè)下限可達(dá)10-11M。 此外，我們使用大豆磷脂包被半胱氨酸，制備了一種可控制釋放的脂質(zhì)體微囊探針。在免疫分析中，通過(guò)包入的半胱氨酸的釋放，實(shí)現(xiàn)被分析物的高靈敏