利拉魯肽對糖尿病大鼠自噬及胰腺脂肪沉積作用機制的研究.pdf

1、目的：
　　通過觀察胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動劑利拉魯肽干預糖尿病大鼠后胰腺自噬相關標志物LC3BmRNA及其蛋白表達的變化，光鏡觀察胰腺脂肪沉積情況；加用氯喹阻斷自噬通路后，比較上述指標變化，探討自噬與胰腺脂肪沉積的關系及利拉魯肽通過調節(jié)自噬改善胰腺脂肪沉積的作用機制。
　　方法：
　　以糖耐量正常大鼠（NGT組）作為對照，建立糖尿病大鼠模型，成模后隨機分為三組：生理鹽水對照組（DMNS組）、利拉魯肽干

2、預組（DMLIR組）及利拉魯肽+氯喹組（DMLIR+CQ組）。DMNS組皮下注射生理鹽水作為空白對照，DMLIR組皮下注射利拉魯肽，觀察利拉魯肽干預后大鼠胰腺自噬水平及胰腺脂肪沉積的變化， DMLIR+CQ組皮下注射利拉魯肽及自噬抑制劑氯喹，觀察在利拉魯肽基礎上阻斷自噬通路后胰腺脂肪沉積的變化。
　　1.糖尿病大鼠模型制備：以36只4~5周齡的健康雄性Wistar大鼠為研究對象，體重180~200g，每籠6只，適應性喂養(yǎng)1周后，采

3、用簡單隨機抽樣法分為糖耐量正常組（NGT組，10只）和糖尿病組（DM組，26只）。NGT組以基礎飼料喂養(yǎng)，每克飼料提供熱量13.4kJ，其中脂肪占10.2％，蛋白質占23.3%，碳水化合物66.5%。DM組以高糖高脂飼料喂養(yǎng)，每克飼料提供熱量21.8kJ，其中脂肪占56.0%，蛋白質占7%，碳水化合物37.0%。早晚各喂養(yǎng)1次，飲水自由。飼養(yǎng)環(huán)境：光照12小時，室溫18~22℃，相對濕度30%～70%，每2周測大鼠體重、空腹血糖（FBG

4、）。12周時，NGT組FBG為4.4~4.9 mmol/L，DM組血糖為5.3~5.9mmol/L，隔夜禁食12h后，DM組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素溶液（25mg/Kg），NGT組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72h后鼠尾采血測FBG，以FBG≥7.8mmol/L并持續(xù)一周以上為糖尿病造模成功，其中DM組造模成功25只，死亡1只。NGT組大鼠血糖均在正常范圍內。
　　2.大鼠分組及檢測指標：糖耐量正常組（NGT組，10只

5、）繼續(xù)予基礎飼料喂養(yǎng)。造模成功后，25只糖尿病大鼠采用簡單隨機抽樣法分為三組：生理鹽水對照組（DMNS組，n=9）、利拉魯肽干預組（DMLIR組，n=8）及利拉魯肽+氯喹組（DMLIR+CQ組，n=8），三組繼續(xù)予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。DMLIR組以100ug/Kg每天兩次腹部皮下注射利拉魯肽溶液，DMLIR+CQ組以100ug/Kg每天兩次腹部皮下注射利拉魯肽溶液，并以50mg/Kg每三天一次腹腔注射氯喹溶液，DMNS組、NGT組腹部注射

6、等體積生理鹽水，每周測定各組大鼠體重及FBG。上述藥物干預大鼠4周后，隔夜禁食12h后，測定體重，鼠尾采血測定FBG、50%葡萄糖注射液灌胃（4ml/Kg）2小時后測定2hBG。次日空腹腹腔注射20%烏拉坦溶液（4ml/Kg）麻醉大鼠，開腹后經腹主動脈取血，測定空腹胰島素（FINS）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL-C）。取三塊約100mg的胰腺組織，錫箔紙包裹于液氮罐中保存，待行實時熒

7、光定量PCR測定LC3B mRNA水平，通過擴增曲線使用2-△△CT進行線性轉換后進行定量計算。以脾臟為標記，取胰腺尾部浸泡于10%甲醛液固定48h后石蠟包埋，備做病理切片，用于免疫組化測定LC3B蛋白的表達，顯色結果采用ScanScope GS掃描儀分析，隨機選取5個LC3B蛋白陽性表達區(qū)域，在400倍視野下計算染色區(qū)域的灰度值（灰度值與蛋白表達水平呈反比），取平均值進行統計分析。光鏡下隨機選取5個視野，40倍物鏡下計算胰島內空泡細胞

8、與胰島細胞總數的比值，取平均值評價胰腺脂肪沉積情況。分離內臟脂肪、稱重，并計算內臟脂肪與體重的比值即內臟脂肪相對含量（VF/W）。
　　3.統計學方法：上述指標均為計量資料，以均數±標準差表示，運用SPSS13.0統計軟件分析。NGT、DMNS、DMLIR、DMLIR+CQ四組實驗數據均滿足正態(tài)分布和方差齊性。組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）、LSD檢驗。DM組LC3B mRNA與FBG、TG、TC、FINS、VF/W、空

9、泡細胞/總胰島細胞的相關性采用Pearson相關分析，通過多元逐步回歸法確定自噬的影響因素，以P≤0.05為差異有統計學意義。
　　結果：
　　1.各組大鼠一般特征比較：適應性喂養(yǎng)期間，大鼠飲食量、體重無明顯差異，精神狀態(tài)良好，毛色光澤。造模期間，DM組大鼠較NGT組大鼠飲食量、體重均增加，DM組大鼠體型肥胖、少動。造模成功后，藥物干預期間，NGT組大鼠飲食量較前無變化，體重呈穩(wěn)定增長；DMNS組大鼠較同期NGT組大鼠體重增

10、加，少動；DMLIR組大鼠較同期DMNS組大鼠飲食量、體重均下降，精神狀態(tài)良好；DMLIR+CQ組大鼠精神萎靡，有脫毛現象，較同期DMNS組大鼠飲食量、體重均下降，與同期DMLIR組大鼠比較，飲食量、體重無差別。
　　與NGT組比較，DMNS組大鼠VF/W升高，差異有統計學意義（P﹤0.05）；與DMNS組比較，DMLIR組大鼠VF/W降低，差異有統計學意義（P﹤0.05）；DMLIR+CQ組大鼠VF/W差異無統計學意義（P＞0.

11、05）。
　　2.各組大鼠生化指標比較：與NGT組比較，DMNS組大鼠FBG、2hBG、FINS、TG、TC、LDL-C升高，HDL降低，差異有統計學意義（P﹤0.05）。與DMNS組比較，DMLIR組大鼠FBG、2hBG、FINS、TG、TC、LDL-C降低，HDL升高，差異有統計學意義（P﹤0.05）；DMLIR+CQ組FBG、2hBG、HDL降低，FINS、TG、TC、LDL-C升高，差異有統計學意義（P﹤0.05）。

12、>　　3.各組大鼠胰腺自噬水平及脂肪沉積比較：與NGT組比較，DMNS組大鼠LC3B mRNA及蛋白表達、空泡細胞/總胰島細胞升高，差異有統計學意義（P﹤0.05）。與DMNS組比較，DMLIR組大鼠LC3B mRNA及蛋白表達升高、空泡細胞/總胰島細胞下降，差異有統計學意義（P﹤0.05）；DMLIR+CQ組大鼠LC3B mRNA及蛋白表達下降、空泡細胞/總胰島細胞升高，差異有統計學意義（P﹤0.05）。
　　光鏡下觀察胰腺脂肪

13、沉積情況：NGT組大鼠胰腺由團索狀的胰島及周圍外分泌部腺泡組成，胰島散在分布，結構規(guī)則，胰島內細胞排列緊密，細胞核呈圓形并居中，細胞內無明顯脂滴，細胞間有豐富的血竇。DMNS組大鼠胰腺小葉間纖維增生，胰島細胞排列紊亂，間隔增寬，部分胰島細胞內可見脂滴，形成空泡細胞。DMLIR+CQ組胰島內胰島細胞排列松散，胰島內血管數量增多，擴張，胰島細胞內脂滴明顯增多，細胞核被推擠變形。DMLIR組胰島組織結構呈現逆轉，胰島細胞數量較DMNS組明顯增