2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:肝纖維化是繼發(fā)于各種慢性肝臟疾病之后反復(fù)的創(chuàng)傷愈合與瘢痕修復(fù)過程,其主要病理生理學(xué)特征是細胞外基質(zhì)(Extrcellular matrix,ECM)的生成與降解失衡,引起ECM的大量沉積,最終導(dǎo)致肝纖維化。為了進一步探討ET-1及PTEN在HSCs激活方面的作用,本實驗通過研究過表達PTEN的HSC-T6在外源性ET-1的刺激下所產(chǎn)生的效應(yīng),并應(yīng)用PI3K/AKT信號通路的特異性抑制劑LY294002模擬PTEN對PI3K/AKT

2、信號通路的阻斷作用,探討PTEN是否能夠通過負調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路下調(diào)ETBR的表達從而抑制ET-1引起的HSCs的激活。
  方法:①、實驗分組
  本實驗按以下分組方式進行:1、P組,PTEN轉(zhuǎn)染HSC-T6+ET-1組;2、 V組,空載PTEN的vector轉(zhuǎn)染HSC-T6+ET-1組;3、PB S+ET-1空白對照組;4、L+V組,空載PTEN的vector轉(zhuǎn)染HSC-T6+ET-1+LY294002組;5、

3、PB S+ET-1+LY294002組。
 ?、?、細胞培養(yǎng)
  大鼠肝星狀細胞系HSC-T6購自廣東科學(xué)院,細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 IU/m青霉素、和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,并在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。
  ③、細胞瞬時轉(zhuǎn)染
  在轉(zhuǎn)染前24小時,指數(shù)級生長的HSC-T6以每孔2×105的濃度接種于6孔板,待細胞鋪滿70%-80%的培養(yǎng)孔時開始轉(zhuǎn)染。PTEN及空載PTEN

4、的vector采用lipofectamine2000,根據(jù)試劑盒說明,以最終100nM的濃度轉(zhuǎn)染進入HSC-T6,并設(shè)置PBS為空白對照組。轉(zhuǎn)染穩(wěn)定后各組加入10-7mol/L ET-1,12h在L+V組及L+PBS組加入50uM/L LY294002,ET-1作用48h后檢測各指標的蛋白質(zhì)及基因水平的表達。
  ④、蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot)
  α-SMA,ETBR及ETAR的蛋白表達水平采用weste

5、rn blot方法檢測。經(jīng)ET-1作用48h后,收集細胞樣品,加入相應(yīng)體積的含有1% Nonidet P-40,0.5%sodium deoxycholate,0.1%sodium dodecyl sulfate和蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液,冰上放置30 min,然后4℃,12000 r/min離心10 min,吸出上清,得到總蛋白樣品。樣品蛋白質(zhì)采用BCA蛋白定量試劑盒定量。調(diào)整樣品蛋白質(zhì)濃度使其接近,保證每個樣品孔蛋白質(zhì)上樣量

6、一致.蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(MILLIPORE)。PVDF膜以5%脫脂奶粉封閉1h后,加入一抗4℃過夜。在此過程中所用到的抗體α-SMA(1;1000 dilution,Santa CruzInc), ETBR(1∶1500 dilution; Santa Cruz Inc.), ETAR(1;1500 dilution; Santa CruzInc), Glyceraldehyde-3-phosph

7、ate dehydrogenase(GAPDH)(1∶1000 dilution;Shanghai Sangon Biotech)。取出PVDF膜,經(jīng)洗滌后,再加入HRP標記的二抗(1∶4000 dilution,F(xiàn)ude Biotech),室溫下孵育1h。每步反應(yīng)結(jié)束均用PBST洗滌3次,每次10 min。最后用ECL化學(xué)發(fā)光3-5min,使用Odyssey成像系統(tǒng)掃膜。結(jié)果以目的蛋白與GAPDH吸光度的比值表示。
 ?、?、實時

8、熒光定量PCR(qRT-PCR)
  ET-1作用后48h,采用Trizol(Invitrogen)試劑盒,按說明提取細胞總RNA。將RNA提取物1ug,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并置于-80℃保存?zhèn)溆谩=?0ul的PCR反應(yīng)體系包括:cDNA,上下游引物、2x SYBR Green qPCR SuperMix、以及dH2O。采用LightCycler480IISystem進行PCR擴增,建立最適的PCR反應(yīng)體系,擴增相應(yīng)的產(chǎn)物。β-a

9、ctin被用作內(nèi)參。ETAR引物序列:上游5'-TCTGATGACCTCGGTCCC-3',下游5'-GTTCATGC TGTCCTTATGGCT-3',ETBR引物序列:上游5'-AATTACGAT GGA CTAC AAA GG AAG TT A-3',下游5'-GCAAGCAGAAATAGAAACTGAATAGC-3'.β-actin引物序列:上游5'-TCACCCACACTGTGCCC ATCTACGA-3',下游5'-CAGC

10、GGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'。
  所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±s)表示。采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
  結(jié)果:1、ET-1作用后各組各指標的變化
 ?、佟T-1作用后各組α-SMA的表達變化
  Western blot檢測結(jié)果顯示,10-7mol/L外源性ET-1作用于各組

11、HSC-T6后,P組α-SMA的相對表達量為(0.35±0.01),明顯低于V組(0.46±0.01)及PBS組(0.46±0.01)(p<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
  ②、ET-1作用后各組ETBR的表達變化
  Western blot檢測結(jié)果顯示,10-7mol/L外源性ET-1作用于各組HSC-T6后,ETBR蛋白的相對表達量在P組為(0.42±0.01)顯著低于V組(0.85±0.01)及PBS組(0.83±

12、0.01),(p<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。qRT-PCR結(jié)果顯示,10-7mol/L外源性ET-1作用于各組細胞后,ETBR mRNA的相對表達量在P組為(0.63±0.06)顯著低于對照組(V組:1.61±0.13,PBS組:1.50±0.03)(p<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
 ?、?、ET-1作用后各組ETAR的表達變化
  Western blot檢測結(jié)果顯示,10-7mol/L外源性ET-1作用于各組HSC

13、-T6后,ETAR蛋白的相對表達量在P組為(0.22±0.01)與V組(0.22±0.01)及PBS組(0.22±0.01)無明顯差異。qRT-PCR結(jié)果顯示,10-7mol/L外源性ET-1作用于各組細胞后,ETAR mRNA的相對表達量在P組為(0.46±0.01),V組(0.46±0.01),PBS組(0.46±0.01),(p>0.05),各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
  2、LY294002作用后各組各指標的變化
 

14、?、?、LY294002作用后各組α-SMA的表達變化
  Western blot檢測結(jié)果顯示,LY294002作用于各組HSC-T6后,α-SMA的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(0.34±0.01,0.34±0.01),顯著低于V組及PBS組α-SMA的表達(p<0.05),但與P組α-SMA的表達無顯著差異(p>0.05)。
 ?、?、LY294002作用后各組ETBR的表達變化
  Western blot

15、檢測結(jié)果顯示,LY294002作用于各組HSC-T6后,ETBR蛋白的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(0.43±0.01,0.44±0.01),顯著低于V組及PBS組(p<0.05),但與P組ETBR蛋白的相對表達無顯著差異(p>0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,ETBR mRNA的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(0.65±0.02,0.64±0.01),顯著低于V組ETBR mRNA的表達(p<0.05),但與P組ETB

16、R的表達無顯著差異(p>0.05)。
 ?、邸Y294002作用后各組ETBR的表達變化
  Western blot檢測結(jié)果顯示,LY294002作用于各組HSC-T6后,ETAR蛋白的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(0.22±0.02,0.23±0.01),與P組、V組及PBS組ETAR蛋白的相對表達量無明顯差異(p>0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示, ETAR mRNA的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(

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