版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
1、目的:肝纖維化是繼發(fā)于各種慢性肝臟疾病之后反復(fù)的創(chuàng)傷愈合與瘢痕修復(fù)過程,其主要病理生理學(xué)特征是細胞外基質(zhì)(Extrcellular matrix,ECM)的生成與降解失衡,引起ECM的大量沉積,最終導(dǎo)致肝纖維化。為了進一步探討ET-1及PTEN在HSCs激活方面的作用,本實驗通過研究過表達PTEN的HSC-T6在外源性ET-1的刺激下所產(chǎn)生的效應(yīng),并應(yīng)用PI3K/AKT信號通路的特異性抑制劑LY294002模擬PTEN對PI3K/AKT
2、信號通路的阻斷作用,探討PTEN是否能夠通過負調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路下調(diào)ETBR的表達從而抑制ET-1引起的HSCs的激活。
方法:①、實驗分組
本實驗按以下分組方式進行:1、P組,PTEN轉(zhuǎn)染HSC-T6+ET-1組;2、 V組,空載PTEN的vector轉(zhuǎn)染HSC-T6+ET-1組;3、PB S+ET-1空白對照組;4、L+V組,空載PTEN的vector轉(zhuǎn)染HSC-T6+ET-1+LY294002組;5、
3、PB S+ET-1+LY294002組。
?、?、細胞培養(yǎng)
大鼠肝星狀細胞系HSC-T6購自廣東科學(xué)院,細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 IU/m青霉素、和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,并在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。
③、細胞瞬時轉(zhuǎn)染
在轉(zhuǎn)染前24小時,指數(shù)級生長的HSC-T6以每孔2×105的濃度接種于6孔板,待細胞鋪滿70%-80%的培養(yǎng)孔時開始轉(zhuǎn)染。PTEN及空載PTEN
4、的vector采用lipofectamine2000,根據(jù)試劑盒說明,以最終100nM的濃度轉(zhuǎn)染進入HSC-T6,并設(shè)置PBS為空白對照組。轉(zhuǎn)染穩(wěn)定后各組加入10-7mol/L ET-1,12h在L+V組及L+PBS組加入50uM/L LY294002,ET-1作用48h后檢測各指標的蛋白質(zhì)及基因水平的表達。
④、蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot)
α-SMA,ETBR及ETAR的蛋白表達水平采用weste
5、rn blot方法檢測。經(jīng)ET-1作用48h后,收集細胞樣品,加入相應(yīng)體積的含有1% Nonidet P-40,0.5%sodium deoxycholate,0.1%sodium dodecyl sulfate和蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液,冰上放置30 min,然后4℃,12000 r/min離心10 min,吸出上清,得到總蛋白樣品。樣品蛋白質(zhì)采用BCA蛋白定量試劑盒定量。調(diào)整樣品蛋白質(zhì)濃度使其接近,保證每個樣品孔蛋白質(zhì)上樣量
6、一致.蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(MILLIPORE)。PVDF膜以5%脫脂奶粉封閉1h后,加入一抗4℃過夜。在此過程中所用到的抗體α-SMA(1;1000 dilution,Santa CruzInc), ETBR(1∶1500 dilution; Santa Cruz Inc.), ETAR(1;1500 dilution; Santa CruzInc), Glyceraldehyde-3-phosph
7、ate dehydrogenase(GAPDH)(1∶1000 dilution;Shanghai Sangon Biotech)。取出PVDF膜,經(jīng)洗滌后,再加入HRP標記的二抗(1∶4000 dilution,F(xiàn)ude Biotech),室溫下孵育1h。每步反應(yīng)結(jié)束均用PBST洗滌3次,每次10 min。最后用ECL化學(xué)發(fā)光3-5min,使用Odyssey成像系統(tǒng)掃膜。結(jié)果以目的蛋白與GAPDH吸光度的比值表示。
?、?、實時
8、熒光定量PCR(qRT-PCR)
ET-1作用后48h,采用Trizol(Invitrogen)試劑盒,按說明提取細胞總RNA。將RNA提取物1ug,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并置于-80℃保存?zhèn)溆谩=?0ul的PCR反應(yīng)體系包括:cDNA,上下游引物、2x SYBR Green qPCR SuperMix、以及dH2O。采用LightCycler480IISystem進行PCR擴增,建立最適的PCR反應(yīng)體系,擴增相應(yīng)的產(chǎn)物。β-a
9、ctin被用作內(nèi)參。ETAR引物序列:上游5'-TCTGATGACCTCGGTCCC-3',下游5'-GTTCATGC TGTCCTTATGGCT-3',ETBR引物序列:上游5'-AATTACGAT GGA CTAC AAA GG AAG TT A-3',下游5'-GCAAGCAGAAATAGAAACTGAATAGC-3'.β-actin引物序列:上游5'-TCACCCACACTGTGCCC ATCTACGA-3',下游5'-CAGC
10、GGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'。
所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±s)表示。采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:1、ET-1作用后各組各指標的變化
?、佟T-1作用后各組α-SMA的表達變化
Western blot檢測結(jié)果顯示,10-7mol/L外源性ET-1作用于各組
11、HSC-T6后,P組α-SMA的相對表達量為(0.35±0.01),明顯低于V組(0.46±0.01)及PBS組(0.46±0.01)(p<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
②、ET-1作用后各組ETBR的表達變化
Western blot檢測結(jié)果顯示,10-7mol/L外源性ET-1作用于各組HSC-T6后,ETBR蛋白的相對表達量在P組為(0.42±0.01)顯著低于V組(0.85±0.01)及PBS組(0.83±
12、0.01),(p<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。qRT-PCR結(jié)果顯示,10-7mol/L外源性ET-1作用于各組細胞后,ETBR mRNA的相對表達量在P組為(0.63±0.06)顯著低于對照組(V組:1.61±0.13,PBS組:1.50±0.03)(p<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
?、?、ET-1作用后各組ETAR的表達變化
Western blot檢測結(jié)果顯示,10-7mol/L外源性ET-1作用于各組HSC
13、-T6后,ETAR蛋白的相對表達量在P組為(0.22±0.01)與V組(0.22±0.01)及PBS組(0.22±0.01)無明顯差異。qRT-PCR結(jié)果顯示,10-7mol/L外源性ET-1作用于各組細胞后,ETAR mRNA的相對表達量在P組為(0.46±0.01),V組(0.46±0.01),PBS組(0.46±0.01),(p>0.05),各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
2、LY294002作用后各組各指標的變化
14、?、?、LY294002作用后各組α-SMA的表達變化
Western blot檢測結(jié)果顯示,LY294002作用于各組HSC-T6后,α-SMA的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(0.34±0.01,0.34±0.01),顯著低于V組及PBS組α-SMA的表達(p<0.05),但與P組α-SMA的表達無顯著差異(p>0.05)。
?、?、LY294002作用后各組ETBR的表達變化
Western blot
15、檢測結(jié)果顯示,LY294002作用于各組HSC-T6后,ETBR蛋白的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(0.43±0.01,0.44±0.01),顯著低于V組及PBS組(p<0.05),但與P組ETBR蛋白的相對表達無顯著差異(p>0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,ETBR mRNA的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(0.65±0.02,0.64±0.01),顯著低于V組ETBR mRNA的表達(p<0.05),但與P組ETB
16、R的表達無顯著差異(p>0.05)。
?、邸Y294002作用后各組ETBR的表達變化
Western blot檢測結(jié)果顯示,LY294002作用于各組HSC-T6后,ETAR蛋白的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(0.22±0.02,0.23±0.01),與P組、V組及PBS組ETAR蛋白的相對表達量無明顯差異(p>0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示, ETAR mRNA的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 胰島素經(jīng)PI3K-GSK3β信號通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞內(nèi)皮素-1基因表達.pdf
- 內(nèi)皮素-1引起搔癢的分子機制研究.pdf
- 內(nèi)皮素-1對大鼠肝星狀細胞作用的實驗研究.pdf
- 川崎病患兒內(nèi)皮素-1及內(nèi)皮素A、B受體基因多態(tài)性研究.pdf
- 丹參素對肝星狀細胞中PI3-K-Akt信號通路的影響.pdf
- β-欖香烯通過PI3K-Akt信號傳導(dǎo)通路抑制血管內(nèi)皮細胞增殖的研究.pdf
- κ阿片受體通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮素及其受體信號通路參與抗缺血性心律失常的研究.pdf
- 內(nèi)皮素-1及內(nèi)皮素A受體拮抗劑對大鼠腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響.pdf
- 脂聯(lián)素對內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的肝星狀細胞收縮的影響及作用機制研究.pdf
- 內(nèi)皮素-1及內(nèi)皮素受體拮抗劑在腎臟間質(zhì)纖維化中作用的研究.pdf
- 刺槐素靶向RARγ-PI3K-AKT信號通路的抗癌機制.pdf
- 蛇床子素通過PI3K-Akt通路抑制肝內(nèi)膽管癌的作用及機制研究.pdf
- 胰島素受體底物1通過PI3K-Akt通路下調(diào)大鼠成骨細胞NFκB和BAX表達促進成骨細胞增殖.pdf
- 內(nèi)皮素受體拮抗劑的研究.pdf
- 木犀草素通過PI3K-Akt途徑調(diào)節(jié)巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化抑制凋亡的機制研究.pdf
- 糖皮質(zhì)激素通過PI3K-Akt細胞信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細胞功能失調(diào).pdf
- α-受體阻滯劑和β-受體阻滯劑對內(nèi)皮素-1介導(dǎo)肝星狀細胞收縮的影響.pdf
- 內(nèi)皮素、內(nèi)皮素受體拮抗劑與糖尿病腎病發(fā)病機制的研究進展.pdf
- 丹蔞片通過PI3K-Akt信號通路促血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移的機制研究.pdf
- PI3K-Akt信號通路與肝星狀細胞活化的關(guān)系及其在放射性肝纖維化中的作用.pdf
評論
0/150
提交評論