動(dòng)力性三維細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠胰腺導(dǎo)管來(lái)源干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的研究.pdf

1、胰島細(xì)胞移植是治療糖尿病的最佳有效方法之一，然而胰島細(xì)胞移植對(duì)供胰的需求量大（需要2-4個(gè)成人胰腺），胰島來(lái)源不足是目前限制其臨床應(yīng)用的重要原因。因此探索新的胰島細(xì)胞途徑成為研究的熱門(mén)研究之一。近年來(lái)，隨著組織工程及細(xì)胞工程的日益起色，干細(xì)胞研究為擴(kuò)大胰島來(lái)源開(kāi)辟了新的路線。
　　機(jī)體在生理狀態(tài)下，或者受到損傷時(shí)，體內(nèi)許多細(xì)胞死亡，但有些器官能夠更新這些細(xì)胞，從而可以使機(jī)體的正常機(jī)能得以維持，這種再生潛能便是依賴(lài)于成體干細(xì)胞(ad

2、ult stem cell，ASC)。胰腺在肥胖或妊娠的情況下也能夠發(fā)生生理性增生，提示在胰腺內(nèi)也存在可以增殖分化的成體干細(xì)胞[1]。與其它成體干細(xì)胞相比，胰腺干細(xì)胞的研究較為滯后。目前還沒(méi)有建立獲得廣泛認(rèn)同的胰腺干細(xì)胞系[2]。根據(jù)發(fā)生學(xué)起源，胰腺內(nèi)的成體干細(xì)胞屬于起源于中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞，它的特點(diǎn)是具有多向分化潛能并且能夠自我更新，可分化為胰腺組織的各種細(xì)胞。目前認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞可能是可誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)的祖細(xì)胞（或稱(chēng)前體細(xì)

3、胞），有望成為解決胰島來(lái)源的途徑[3]。
　　目前，胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞存在的部位還沒(méi)有完全確定。胰島內(nèi)部、胰腺外分泌腺內(nèi)、胰腺導(dǎo)管內(nèi)均可能存在分化程度不同的干細(xì)胞或祖細(xì)胞[4]。目前研究認(rèn)為朗罕氏胰島可由胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞及位于胰島內(nèi)部的胰島源性前體細(xì)胞(islet-derived precursor cells，IPCs)分化新生而成。多個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道離體分離培養(yǎng)的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，經(jīng)條件培養(yǎng)后能獲得成纖維樣細(xì)胞，表達(dá)CD13、CD2

4、9、CD44、CD49b、CD54等抗原，與間充質(zhì)干細(xì)胞相一致[5、6]。將這些培養(yǎng)后的胰島樣細(xì)胞移植入糖尿病小鼠體內(nèi)，可釋放胰島素，降低血糖，延長(zhǎng)受體存活時(shí)間。這些研究為建立工程性β細(xì)胞系以獲得無(wú)限的胰島細(xì)胞來(lái)源帶來(lái)了新的曙光。
　　以目前的技術(shù)，在分離純化胰島過(guò)程中，只有不到10％的胰島組織得以應(yīng)用，其余均被廢棄。胰導(dǎo)管正是存在于被“廢棄”的組織中。如果能夠分離并誘導(dǎo)其增殖分化為有功能的胰島樣細(xì)胞團(tuán)，將為擴(kuò)大胰島來(lái)源提供新的途

5、徑。
　　胰腺導(dǎo)管來(lái)源干細(xì)胞作為成體干細(xì)胞，操作方法要比胚胎干細(xì)胞容易，而且具有較高的成功率，此外，成體干細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)也要低很多，更加可以規(guī)避倫理學(xué)問(wèn)題[7、8])。在人與哺乳動(dòng)物特定組織與器官中，有許多成體干細(xì)胞存在，這些細(xì)胞是自我更新能力很強(qiáng)，并且具有一定分化潛能的前體細(xì)胞，這些細(xì)胞成熟并可以分化，成為所屬組織的細(xì)胞類(lèi)型。新近的研究表明，成體干細(xì)胞屬多能干細(xì)胞，具有“可塑性”，即可分化生成另一組織的特定細(xì)胞，保持向多

6、種組織分化的能力[10]。因此，綜上所述，如果能夠?qū)⒁认匍g充質(zhì)干細(xì)胞在體外通過(guò)一定的方法使其增殖并定向分化為胰島細(xì)胞，則有望應(yīng)用于臨床，治療糖尿病。
　　目前，盡管細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)成熟且方法多樣，經(jīng)胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化所獲得的胰島樣細(xì)胞，在外形上與朗罕氏胰島結(jié)構(gòu)相近，但功能上難以達(dá)到臨床細(xì)胞替代治療的目的。具體表現(xiàn)在[9]：①體外誘導(dǎo)獲得的胰島樣結(jié)構(gòu)中，內(nèi)分泌細(xì)胞的所占比例較小，而且細(xì)胞連接缺乏;②合成和釋放胰島素的量比正常值低;

7、③在應(yīng)對(duì)葡萄糖的刺激時(shí)，缺乏胰島素的急性分泌反應(yīng);④胞漿中分泌胰島素顆粒缺乏;⑤胰島樣結(jié)構(gòu)分化不徹底，其內(nèi)尚含有未分化細(xì)胞，以及部分分化的細(xì)胞。因此目前所應(yīng)用的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化方案存在著不完善，如何最大程度的模擬體內(nèi)微環(huán)境是一個(gè)明確的研究方向。
　　最近學(xué)界新興了一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，即為三維細(xì)胞培養(yǎng)(three-dimension cell culture，TDCC)，其特點(diǎn)是應(yīng)用三維結(jié)構(gòu)載體，與細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，這樣細(xì)胞便能在載體

8、的三維空間中定植生長(zhǎng)，最后形成細(xì)胞載體復(fù)合物，細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境達(dá)到體內(nèi)環(huán)境最大程度的模擬。
　　目前三維細(xì)胞培養(yǎng)可分為兩類(lèi)，靜止性及動(dòng)力性三維培養(yǎng)，動(dòng)力性三維培養(yǎng)在更加具有優(yōu)勢(shì)，具體表現(xiàn)為[10]：①黏附生長(zhǎng)細(xì)胞的增殖加快，細(xì)胞外基質(zhì)提供的更豐富，組織再生能力更好;;②細(xì)胞植入數(shù)量能夠達(dá)到最大化;③氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向載體內(nèi)部輸送更加充分，細(xì)胞活性更加易于保持;④細(xì)胞能夠沿著孔隙生長(zhǎng)，成為三維立體組織;⑤培養(yǎng)液流動(dòng)過(guò)程中，細(xì)胞受到機(jī)械應(yīng)力

9、的刺激，細(xì)胞功能得以最大程度發(fā)揮;⑥CO2可以被更快的排出，生理性pH值得以維持，細(xì)胞代謝和功能能夠在最有利的微環(huán)境中進(jìn)行。因此，動(dòng)力性三維細(xì)胞培養(yǎng)不僅在生物性微環(huán)境和力學(xué)刺激方面提供優(yōu)勢(shì)，而且細(xì)胞功能能夠得到最大程度發(fā)揮。動(dòng)力性三維細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)之聚合三維支架材料及生物灌注反應(yīng)系統(tǒng)已商品化，可方便購(gòu)得。
　　目的：
　　本研究擬利用胰島分離后的大鼠胰腺組織（含有外分泌細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞）分離胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，完善胰腺導(dǎo)管細(xì)胞分離

10、方法，利用動(dòng)力性三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)使其增殖并分離，通過(guò)鑒定確認(rèn)為胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)持續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)建立起大鼠的胰腺干細(xì)胞系，并誘導(dǎo)其向可釋放胰島素的胰島樣細(xì)胞團(tuán)定向分化，探索完善誘導(dǎo)分化所需條件及更合適的體外微環(huán)境，確定誘導(dǎo)細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)、表達(dá)特性和功能。本研究以大鼠胰腺作為研究對(duì)象，建立大鼠的胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞系，采用新興的動(dòng)力性三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，模擬體內(nèi)微環(huán)境，為改進(jìn)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)方法提供新的思路。為解決胰島來(lái)源提供新的途徑。
　　

11、方法：
　　原料采用大鼠的胰腺組織，應(yīng)用0.1％V型膠原酶對(duì)大鼠胰腺組織進(jìn)行原位消化分離，通過(guò)不連續(xù)密度梯度離心的方法，使得胰島細(xì)胞和胰腺導(dǎo)管細(xì)胞初步分離，將胰島細(xì)胞廢棄，留取胰腺導(dǎo)管細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在動(dòng)力性三維細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果為獲得原代PDSC，并采用含血清培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，連續(xù)傳代，純化PDSC，完善原代胰腺導(dǎo)管來(lái)源干細(xì)胞的分離方法、探討培養(yǎng)條件以及影響因素。鑒定原代分離的PDSC，包括形態(tài)學(xué)鑒定、表達(dá)特性鑒定

12、，以及分化能力鑒定。連續(xù)傳代，建立胰腺導(dǎo)管來(lái)源干細(xì)胞系。并對(duì)PDSC進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化，使其定向分化為有功能的胰島樣細(xì)胞團(tuán)，并對(duì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定以及表達(dá)特性等方面的鑒定。
　　結(jié)果：
　　通過(guò)原位0.1％V型膠原酶消化，之后進(jìn)行不連續(xù)密度梯度離心，再繼以動(dòng)力性三維培養(yǎng)，可分離培養(yǎng)出大鼠PDSC。形態(tài)學(xué)方面，PDSC呈單個(gè)核。生長(zhǎng)行為方面，PDSC在三維載體上沿纖維貼壁生長(zhǎng)。通過(guò)流式細(xì)胞儀分選進(jìn)行表達(dá)特性分析可以得出，CD1

13、05、CD73、CD29、CD90在PDSC呈高表達(dá)，而CD45、CD14、CD19、CD34呈不表達(dá)，由此可以證明PDSC為間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　在動(dòng)力性三維細(xì)胞培養(yǎng)14天左右，PDSC可以定向分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)(islet-like cell cluster，ICC)。在形態(tài)學(xué)方面可以觀察到ICC表現(xiàn)為細(xì)胞融合，成團(tuán)狀聚集，分化后期自培養(yǎng)基脫壁，呈懸浮生長(zhǎng);表達(dá)特性方面鑒定采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果提示ICC胰島素的染色呈現(xiàn)為陽(yáng)

14、性，提示ICC在蛋白分子水平表達(dá)胰島素;雙硫腙(DTZ)染色結(jié)果顯示，ICC在誘導(dǎo)培養(yǎng)2周時(shí)可以被染成紅色，由此證明細(xì)胞團(tuán)內(nèi)含有胰島素的蛋白分解產(chǎn)物。胰島素定量測(cè)定結(jié)果顯示，ICC在誘導(dǎo)培養(yǎng)14天時(shí)，其細(xì)胞外液與細(xì)胞的胞漿內(nèi)均含可以檢測(cè)得到胰島素水平，與誘導(dǎo)培養(yǎng)前的PDSC的細(xì)胞胞漿內(nèi)的胰島素水平做比較，有顯著性差異(P＜0.01);但葡萄糖刺激下胰島素釋放試驗(yàn)結(jié)果顯示，ICC的釋放指數(shù)SI為1.40，說(shuō)明ICC的胰島素釋放為非細(xì)胞外液

15、葡萄糖濃度依賴(lài)性，即ICC仍是未成熟的胰島素分泌細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1.完善胰腺導(dǎo)管細(xì)胞分離方法：采用原位膠原酶消化法，通過(guò)不連續(xù)密度梯度離心分離，再繼以動(dòng)力性三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，可以得到大鼠PDSC，并成功建立PDSC細(xì)胞系。
　　2.大鼠PDSC是一種表達(dá)PDX-1和nestin的MSC。
　　3.通過(guò)體外動(dòng)力性三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，可誘導(dǎo)胰腺PDSC定向分化為有功能的胰島樣細(xì)胞團(tuán)。
　　4.