PHⅡ-7抗腫瘤機(jī)制的研究.pdf

1、化療是目前治療腫瘤的主要方法之一，尤其對血液腫瘤和轉(zhuǎn)移性高的實體瘤化療更是尤為重要的治療方法。然而一些腫瘤細(xì)胞獲得對化療藥物的耐藥性往往導(dǎo)致臨床上化療失敗。根據(jù)美國癌癥協(xié)會估計，每年癌癥患者約49萬例死亡，其中61％的腫瘤屬內(nèi)在性耐藥,33%屬獲得性耐藥?？傊?，90%以上腫瘤患者死亡在不同程度上是受耐藥影響的。許多天然來源的抗腫瘤藥物如生物堿類抗腫瘤藥物（秋水仙堿、長春堿、三尖杉酯堿等），蒽環(huán)類抗生素（阿霉素和柔紅霉素），鬼臼毒素類(V

2、p-16)及某些化學(xué)合成藥（米托蒽醌和胺苯丫啶）都極易發(fā)生多藥耐藥。新發(fā)現(xiàn)的藥物如紫杉醇和治療慢性粒細(xì)胞白血病的STI-571，都是剛用于臨床就發(fā)現(xiàn)有耐藥性，使得問題更加嚴(yán)重。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，P-gp在許多難治及復(fù)發(fā)的血液病及以乳腺癌為代表的實體瘤組織中表達(dá)升高，是臨床上造成化療失敗的主要原因。人們研究的MDR逆轉(zhuǎn)劑種類繁多，包括化學(xué)合成藥物、天然藥物、單克隆抗體、基因調(diào)節(jié)因子等，其中MDR小分子抑制劑的研制已經(jīng)歷了三代發(fā)展過

3、程。盡管這些抑制劑在體外實驗中有不錯的活性，然而由于它們對P-gp較低的特異性或?qū)ζ渌幬锼幋鷦恿W(xué)的影響，這些抑制，劑都止步于臨床應(yīng)用。
　　 1．PHⅡ-7通過升高活性氧誘導(dǎo)K562和K562/A02細(xì)胞凋亡
　　 PHⅡ-7是靛玉紅的衍生物，在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)，PHⅡ-7對許多不同來源的腫瘤細(xì)胞，尤其是耐藥的腫瘤細(xì)胞有效。我們的實驗結(jié)果表明，PHⅡ-7對敏感及耐藥的血液腫瘤細(xì)胞K562、K562/A02均有生長

4、抑制作用，24hrIC50接近，分別為2.37和1.97μM。進(jìn)一步的研究表明PHⅡ-7作用之后能引起細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的升高，GSH、NAC等抗氧化劑能拮抗PHⅡ-7的生長抑制作用。同時caspase抑制劑也能在很大程度上拮抗PHⅡ-7對細(xì)胞的殺傷作用，提示PHⅡ-7發(fā)揮作用的主要機(jī)制可能與升高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。許多研究表明，升高的活性氧水平往往會對細(xì)胞內(nèi)的許多生物大分子如DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)造成氧化損傷。在我們的實驗

5、中，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平在PHⅡ-7作用之后2hr出現(xiàn)微弱的升高，而后在llhr出現(xiàn)爆發(fā)式高峰，然后下降。彗星電泳實驗
　　 證實了PHⅡ-7作用之后會造成嚴(yán)重的DNA損傷，損傷的DNA激活細(xì)胞內(nèi)的周期關(guān)鍵檢測點，造成細(xì)胞周期阻滯在S期。WesternBlot實驗發(fā)現(xiàn)PHⅡ-7作用之后周期相關(guān)蛋白p21、CDK2的表達(dá)發(fā)生改變。而用抗氧化劑NAC與細(xì)胞預(yù)孵育后，可以極大的抑制S期阻滯的發(fā)生。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，不同活性氧水平會決定細(xì)胞

6、的生存狀態(tài)。我們的結(jié)果表明，在較微弱的活性氧的作用下（PHⅡ-7作用llhr之前），首先引起細(xì)胞周期阻滯，在活性氧水平爆發(fā)式增長后(PHⅡ-7作用llhr之后)，流式檢測細(xì)胞凋亡開始顯著增多；熒光顯微鏡下觀察JC-1染色的細(xì)胞紅/綠熒光的比例也降低，這提示著線粒體膜電位的下降，是細(xì)胞凋亡發(fā)生的早期標(biāo)志。WesternBlot顯示PHⅡ-7可以以一種時間和劑量依賴的方式促進(jìn)caspase級聯(lián)系統(tǒng)PARP-1，caspase-3，caspa

7、se-9等蛋白的激活，而抗氧化劑NAC可以抑制上述蛋白的激活，抑制凋亡信號的啟動。Bcl-2和Bax也是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡重要的蛋白分子，PHⅡ-7作用之后可以引起B(yǎng)cl-2蛋白水平的降低及Bax水平的升高，促進(jìn)凋亡信號的產(chǎn)生。NAC至少可以拮抗PHⅡ-7引起的Bcl-2蛋白的下調(diào)，提示活性氧在PHⅡ-7引起的細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡作用中發(fā)揮了重要的作用。
　　 此外，PHⅡ-7對K562/A02具有與其親代敏感細(xì)胞K562近乎

8、相當(dāng)?shù)纳L抑制作用，提示PHⅡ-7對K562/A02的耐藥表型也可能有調(diào)控作用，這在我們實驗室之前的工作中已經(jīng)證實。在本研究中，我們檢測了耐藥細(xì)胞株K562/A02與NAC預(yù)孵育后，PHⅡ-7作用之后細(xì)胞表面P-gp的水平，發(fā)現(xiàn)原本被PHⅡ-7抑制的P-gp蛋白水平恢復(fù)至正常。這一實驗結(jié)果說明ROS可能也參與了PHⅡ-7對P-gp的調(diào)控，盡管其中的具，體機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。
　　 2．PHⅡ-7增強(qiáng)sTRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

9、r>　　 TRAIL是TNF家族唯一一個被發(fā)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用而對正常細(xì)胞沒有影響的蛋白，其可溶形式(sTRAIL，114-281)現(xiàn)在已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗。它對腫瘤殺傷的特異性曾經(jīng)讓無數(shù)研究者興奮，然而進(jìn)一步的研究顯示，一些血液腫瘤及實體瘤尤其是惡性程度高的腫瘤往往對TRAIL引起的凋亡耐受。尋找克服TRAIL耐受的機(jī)制或增強(qiáng)TRAIL對腫瘤細(xì)胞殺傷的策略成為近年來研究的重點。
　　 我們的結(jié)果PHⅡ-7作用于白血病

10、細(xì)胞K562、K562/A02細(xì)胞株及乳腺癌細(xì)胞MCF-7及其耐藥株MCF-7/ADR后，四種細(xì)胞中的TRAIL相關(guān)受體DR4、DR5在mRNA水平均升高，且呈劑量依賴性。我們將可溶性的TRAIL分子（sTRAIL,114-281）與PHⅡ-7聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)聯(lián)用后，原本對TRAIL殺傷耐受的四株細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的生長抑制作用，此抑制作用比兩藥單用的效果均好。我們發(fā)現(xiàn)，PHⅡ-7促進(jìn)sTRAIL對上述腫瘤細(xì)胞的殺傷也很有可能是通過其升高細(xì)胞內(nèi)的

11、活性氧水平實現(xiàn)的。雖然已有許多文獻(xiàn)報道通過與一些化療藥聯(lián)用也可增加腫瘤細(xì)胞對TRAIL殺傷的敏感性，這可能是通過化療藥物對凋亡信號通路的某些調(diào)控實現(xiàn)的。但這些藥物往往對多藥耐藥的腫瘤細(xì)胞無效，不能在耐藥腫瘤細(xì)胞內(nèi)達(dá)到有效治療濃度最終導(dǎo)致這些耐藥的腫瘤細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡仍舊不敏感。我們的藥物PHⅡ-7一方面可以通過降低P-gp的表達(dá)實現(xiàn)在耐藥的腫瘤細(xì)胞中達(dá)到相同的有效濃度，另一方面上調(diào)功能性受體DR4、DR5的表達(dá)，在較低濃度便能

12、促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的凋亡，顯示出不同于普通化療藥物的應(yīng)用價值。
　　 3.c-Fos在乳腺癌中抗凋亡作用的研究
　　 在我們實驗室之前的工作中發(fā)現(xiàn)，PHⅡ-7可以通過下調(diào)c-Fos的表達(dá)抑制乳腺癌的耐藥表型。c-Fos是轉(zhuǎn)錄因子AP-1的重要組成成分，通常與c-Jun以異源二聚體的形式結(jié)合。在第三部分，為了進(jìn)一步研究c-Fos在其中所發(fā)揮的作用，我們在高表達(dá)c-Fos的乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR的基礎(chǔ)上

13、構(gòu)建了穩(wěn)定干擾c-Fos的細(xì)胞株，MA-3D、MA-8B。與對照MA-NC相比，MA-3D和MA-8B對阿霉素的耐藥倍數(shù)顯著下降(分別為142.60±26.67，15.46±0.80及34.34±4.38μM)。MCF-7/ADR細(xì)胞為耐藥細(xì)胞株，有P-gp高表達(dá)，故在本部分研究中，選擇了兩種非P-gp底物的化療藥,5．氟尿嘧啶(5-FU)和順鉑(CDDP)，試圖探索c-Fos與凋亡調(diào)控的關(guān)系。我們的結(jié)果表明，MA-3D和MA-8B對5

14、-FU和CDDP的IC50均有所下降。細(xì)胞凋亡檢測顯示與對照MA-NC相比，干擾組MA-3D及MA-8B的凋亡率升高，且呈劑量依賴。此外，銫源照射后，MA-8B及MA-3D凋亡率也明顯較對照MA-NC高。進(jìn)一步探討其中的機(jī)制我們發(fā)現(xiàn)，干擾組的凋亡相關(guān)蛋白puma，bax，bcl-2及p53表達(dá)量均有所改變(puma，bax，p53表達(dá)升高及bcl-2表達(dá)下降)，最終的結(jié)果干擾c-Fos后，可以促進(jìn)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。我們的實驗結(jié)果顯