多功能納米抗體的構(gòu)建及其抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、自從抗CD20抗體-利妥昔單抗1997年被FDA批準(zhǔn)上市以來，已經(jīng)超過數(shù)十種抗體被用來治療腫瘤。盡管單克隆抗體在治療腫瘤方面取得一定的療效，但其效果溫和。為了提高抗體的治療效果，研究者們將抗體與化療藥物、毒素、免疫因子、放射性核素等制備成復(fù)合物，或者通過融合蛋白技術(shù)制備成多功能抗體。但是這些抗體劑型仍然存在著一些不足，如細(xì)胞毒性更高，瘤內(nèi)富集程度較低，機(jī)制不明，容易產(chǎn)生耐藥等問題。近年來，納米醫(yī)藥由于具有EPR效應(yīng)能夠顯著增強(qiáng)藥物的瘤內(nèi)

2、富集而成為抗腫瘤的研究熱點(diǎn)。目前基于納米技術(shù)的靶向治療主要集中在抗體介導(dǎo)的靶向體系。而圍繞抗體結(jié)構(gòu)組成本身，利用納米技術(shù)，構(gòu)建新型納米尺度的抗體(nano antibody，nAb)研究卻很少。本課題組前期通過納米技術(shù)將Ⅰ和Ⅱ型兩種抗CD20抗體偶聯(lián)制備納米抗體團(tuán)簇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其相比于游離的抗體而言，抗體團(tuán)簇誘導(dǎo)凋亡的能力大大增強(qiáng)。我們認(rèn)為該額外凋亡的增加來源于胞外抗原交聯(lián)?；诖?，我們猜想:進(jìn)一步交聯(lián)或者受限靶細(xì)胞上CD20分子能否促

3、進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)？
　　在本課題中，我們通過化學(xué)合成將Ⅰ型抗CD20抗體連接不同鏈長高分子上(PEIn-R，n=1.8，10，25，50，750 kDa)，實(shí)現(xiàn)不同程度的抗原交聯(lián);同時(shí)，將抗體偶聯(lián)到一個(gè)具有溫敏功能的高分子長鏈(PI-4-R)，該溫敏高分子poly(N-isopropylacrylamide)(PNIPAM)具有最低臨界溶解溫度(Lower critical solution temperature，LCST)，其

4、鏈隨著溫度的升高而收縮，可以實(shí)現(xiàn)抗原的進(jìn)一步受限。動靜態(tài)散射儀(Dynamic/static laser light scattering，DLLS/SLLS)，透射電子顯微鏡(TEM)及SDS-PAGE蛋白電泳膠等手段均證實(shí)不同鏈長PEI-R及PI-4-R成功合成，具有明顯的類似梳狀的結(jié)構(gòu)。且相比單獨(dú)的PI-4載體，接上抗體之后的PI-4-R的LCST提高了接近2℃，這主要是因?yàn)镻I-4鏈上接上大量親水性抗體之后，與水分子間的作用力增

5、強(qiáng)，所以相轉(zhuǎn)變溫度出現(xiàn)相應(yīng)的提高，這也從間接說明PI-4成功與CD20抗體連接。每個(gè)納米抗體鏈上偶聯(lián)的抗體數(shù)目在SLLS上得到進(jìn)一步的計(jì)算，PEI750000-R及PI-4-R上的抗體數(shù)目分別為250和300。納米抗體與抗原的結(jié)合、解離能力檢測結(jié)果表明，與母代游離的Rituximab相比，不同類型的納米抗體與Raji細(xì)胞表面CD20分子的結(jié)合能力相似，但是其解離率卻大大下降，說明納米抗體構(gòu)建成功，暗示其與腫瘤細(xì)胞的相互作用更強(qiáng)。隨后，我

6、們分別采用人血清和人外周血淋巴細(xì)胞來進(jìn)行補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用(Complement-dependent cytotoxicity，CDC)和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(Antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)我們所制備的六種納米抗體具有與Rituximab類似的CDC和ADCC效應(yīng)，說明我們對抗體的改造并未改變母代抗體的結(jié)構(gòu)和功能。
　　然而，我們利用流式細(xì)胞

7、儀對納米抗體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death，PCD）進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，相對于Rituximab，納米抗體獲得了很高的類似于Ⅱ型抗CD20抗體所具有的PCD功能。而且，該P(yáng)CD效應(yīng)隨著鏈長的增加（也就是抗原交聯(lián)程度增加）而明顯增強(qiáng);同時(shí)，在相同抗原交聯(lián)情況下，隨著溫度的升高（抗原受限程度增加），納米抗體誘導(dǎo)的PCD進(jìn)一步增加。隨后，我們通過流式細(xì)胞儀、共聚焦顯微鏡等技術(shù)對納米抗體誘導(dǎo)PCD的機(jī)制進(jìn)一步

8、探討，結(jié)果顯示，當(dāng)進(jìn)一步增加抗原交聯(lián)或抗原受限后，納米抗體誘發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)溶酶體破裂或彌散程度增強(qiáng)，釋放出溶酶體內(nèi)容物組織蛋白酶B增多;而組織蛋白酶B作用于線粒體上的相關(guān)蛋白，導(dǎo)致線粒體通透性增加，釋放出細(xì)胞色素C，進(jìn)而激活下游的Casepase凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。該溶酶體依賴性的凋亡功能在蛋白質(zhì)印跡中得到進(jìn)一步證實(shí)。
　　之后，我們通過皮下荷瘤小鼠（SCID鼠）和原位血液廇（SCID鼠）模型，系統(tǒng)研究了納米抗體的體內(nèi)抑瘤效果。結(jié)果

9、顯示，相比于母代游離抗體組，納米抗體組治療后小鼠具有更高的生存率，荷瘤小鼠的生存時(shí)間顯著延長，腫瘤體積縮小，證實(shí)納米抗體誘導(dǎo)的PCD效應(yīng)能夠在小鼠體內(nèi)發(fā)揮作用。而且，實(shí)體瘤結(jié)果證明，該納米抗體能夠通過EPR明顯增強(qiáng)瘤內(nèi)富集，具有更好的療效。
　　綜上所述，相比游離單克隆抗體(mAb)，利用納米技術(shù)所構(gòu)建的納米抗體(nAb)能夠賦予母代抗體不具備的凋亡誘導(dǎo)功能，并通過CDC、ADCC和PCD發(fā)揮作用，且該作用能夠被納米粒子所特有的E