eha基因對遲緩愛德華菌及其在巨噬細胞內存活的影響.pdf

1、EffectsofehagenetoEdwardsiellatardaandit’SsurvivinginMacrophagesADissertationSubmitiedtoSoutheastUniversityFortheAcademicDegreeofMasterofMedicineBYLIYuhongSupervisedbyAssociatedProfessorGAODaqingSchooIofMedicineSoutheast

2、UniversityMay2013中文摘要幽a基因對遲緩愛德華菌及其在巨噬細胞內存活的影響中文摘要遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda，簡稱Et)是一種重要的人獸共患病原菌，能夠在巨噬細胞內生存和繁殖，是其致病的關鍵。Et溶血調控基因(Ethaemolysinactivatorgene，簡稱eha)是一個重要的轉錄調控基因，能夠調控Et的某些毒力因子。已有研究表明，eha基因可能與Et的胞內生存有關，但是該基因如何影響該菌的

3、胞內生存機制及其毒力尚未闡明。WST-8和LDH細胞毒性檢測結果均表明，野生株的細胞毒性明顯高于eha缺失株，在電鏡和倒置光學顯微鏡下也觀察到這一現(xiàn)象。eha缺失株在SDS和多粘菌素B脅迫環(huán)境中的存活率明顯降低，表明eha基因的缺失可能影響Et菌體相關成分的合成。RT-PCR結果表明，野生株中外膜蛋白基因pagC的轉錄水平高于eha缺失株；qRT-PCR結果顯示eha缺失株dOpagC的轉錄水平為野生株的045倍。SDSPAGE電泳也顯

4、示，野生株的三種外膜蛋白表達水平高于eha缺失株，其中37kD外膜蛋白是誘導體液和細胞免疫保護抗體的重要抗原。因此，eha基因通過影響Et菌體相關成分的合成，影響Et菌在脅迫環(huán)境中的存活率。流式凋亡檢測和電鏡觀察結果顯示，eha缺失株感染細胞組的細胞凋亡率高于野生株感染細胞組，提示eha基因可抑制Et引起巨噬細胞凋亡的作用。RT-PCR結果顯示，eha基因上調Et中Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌蛋白C和鞭毛蛋白C的表達，而Ⅲ型分泌系統(tǒng)可抑制宿主細胞的

5、凋亡。但是eha基因是否通過調控IⅡ型分泌系統(tǒng)的表達而影響Et對巨噬細胞的凋亡作用，還有待探討。通過Et感染RAW2647細胞，菌落計數(shù)法測定其胞內存活及電鏡、光鏡觀察結果表明，野生株和eha缺失株均可在巨噬細胞內存活和繁殖，但和野生株相比，eha缺失株在巨噬細胞內的繁殖速率明顯下降。模擬巨噬細胞內強氧化環(huán)境的應激實驗結果表明，相比野生株，eha缺失株對過氧化氫的敏感性顯著提高，在過氧化氫中的存活率明顯降低。流式檢測細菌感染后巨噬細胞產

6、生活性氧的水平，結果顯示，eha缺失株感染細胞組(6549％)高于野生株組(5532％)。進一步用RT-PCR和qRT-PCR實驗結果表明，eha基因的缺失下調了Et中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的轉錄水平；eha缺失株中sodC和勛燈的轉錄水平分別為野生株的01倍和042倍。這提示eha基因通過調控Et中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的表達，從而影響其分解巨噬細胞中活性氧的能力和在不同濃度過氧化氫中的存活率。模擬巨噬細胞吞噬溶酶體中酸性環(huán)境